[發(fā)明專利]利用微滴數(shù)字PCR檢測(cè)α珠蛋白基因拷貝數(shù)的引物探針、試劑盒及應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110987195.3
• 申請(qǐng)日: 2021-08-26
• 公開（公告）號(hào): CN113755568B
• 公開（公告）日: 2023-09-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 杜麗;包秀勤;秦丹卿;王繼成;張亮;馬健;周香城;姚翠澤
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣東省婦幼保健院
• 主分類號(hào): C12Q1/6883
• 分類號(hào): C12Q1/6883;C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 廣州市華學(xué)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44245
• 代理人: 蘇運(yùn)貞

1.一種利用微滴數(shù)字PCR檢測(cè)α珠蛋白基因拷貝數(shù)的引物探針，其特征在于：包括檢測(cè)引物對(duì)、檢測(cè)探針、內(nèi)參基因的上游引物、內(nèi)參基因的下游引物和內(nèi)參基因的探針；

檢測(cè)引物對(duì)如下：

HBA-2上游引物：5’-GGTTGCGGGAGGTGTAGC-3’；

HBA-2下游引物：5’-?GTGGCTTAGGAGCTGTGCAG?-3’；

檢測(cè)探針如下：

HBA1?Probe：5’-?FAM-CCCTCGGCCCCACTGACCCTCTT-BHQ1-3’；

HBA2?Probe：5’-?FAM-CCTGGGCCGCACTGACCCTCTTC-BHQ1-3’?；所述的內(nèi)參基因?yàn)镽PP30基因；所述的內(nèi)參基因的上游引物如下：

RPP30上游引物：5’-?GATTTGGACCTGCGAGC?-3’；

所述的內(nèi)參基因的下游引物如下：

RPP30下游引物：5’-?GGTTGGCCAGGCGCGAAG-3’；

所述的內(nèi)參基因的探針如下：

RPP30?Probe：5’-?VIC-CTGACCTGAAGGCTCT-MGB-3’。

2.一種利用微滴數(shù)字PCR檢測(cè)α珠蛋白基因拷貝數(shù)的試劑盒，其特征在于：包括權(quán)利要求1所述的利用微滴數(shù)字PCR檢測(cè)α珠蛋白基因拷貝數(shù)的引物探針。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于：還包括用于PCR的酶、dNTP和用于PCR的超純水中的至少一種。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于：包括2×不含dUTP的ddPCR?supermixfor?probe。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于：所述的試劑盒中的各成分反應(yīng)時(shí)的終濃度如下：HBA-2上游引物250nM、HBA-2下游引物?250nM、HBA1?probe?250nM、HBA2?probe250nM、1×不含dUTP的ddPCR?supermix?for?probe。

6.權(quán)利要求1所述的引物探針或權(quán)利要求2～5任一項(xiàng)所述的試劑盒在非診斷和治療目的的檢測(cè)α珠蛋白基因拷貝數(shù)中的應(yīng)用。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于包括以下步驟：

（1）對(duì)待測(cè)樣本提取基因組DNA；

（2）使用上述引物探針或上述試劑盒中的引物探針對(duì)HBA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增；特異性引物和熒光標(biāo)記的探針對(duì)HBA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增的區(qū)域是位于HBA1基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)下游+529bp-+615bp和HBA2：+529bp-+608bp；HBA1和HBA2具有高度同源性，但在該區(qū)域內(nèi)兩者存在幾個(gè)堿基的區(qū)別，HBA1是CTCGGCCC，而HBA2在此處是G，根據(jù)這個(gè)特點(diǎn)設(shè)計(jì)分別針對(duì)HBA1和HBA2的探針；采用內(nèi)參基因計(jì)算拷貝數(shù)；

（3）將步驟（2）得到的熒光標(biāo)記的PCR產(chǎn)物放入微滴分析儀，分析每個(gè)樣品的微滴的熒光信號(hào)；拷貝數(shù)計(jì)算方法如下：目的基因拷貝數(shù)=（目的基因濃度值/參考基因濃度值）×內(nèi)參基因拷貝數(shù)；內(nèi)參基因拷貝數(shù)為2；目的基因拷貝數(shù)為0時(shí)，檢測(cè)出來的拷貝數(shù)值為0；拷貝數(shù)值在0.6-1.3之間，則認(rèn)為拷貝數(shù)為1；拷貝數(shù)值在1.5-2.2之間，則認(rèn)為拷貝數(shù)為2；拷貝數(shù)值在2.5-3.2之間，則認(rèn)為拷貝數(shù)為3；拷貝數(shù)值在3.5-4.2之間，則認(rèn)為拷貝數(shù)為4；以此類推；介于這些區(qū)間的值無法判斷時(shí)，則需重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。