[發(fā)明專利]用于pAPN基因定點修飾的系統(tǒng)及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110985540.X
• 申請日: 2021-08-26
• 公開（公告）號: CN113957093B
• 公開（公告）日: 2022-09-20
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李奎;牟玉蓮;徐長江;劉志國
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/113;C12N15/12;C12N15/57;C12N5/10;C12N15/877;A01K67/027
• 代理公司: 北京超凡宏宇專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11463
• 代理人: 徐樂

1.一種用于pAPN基因定點修飾的產(chǎn)品，其特征在于，含有第一載體、第二載體和供體DNA；

所述第一載體包括基因編輯蛋白表達(dá)盒和第一sgRNA表達(dá)盒；

所述第二載體包括基因編輯蛋白表達(dá)盒和第二sgRNA表達(dá)盒；

第一sgRNA和第二sgRNA分別靶向pAPN基因的兩個靶位點；

所述供體DNA含有pAPN基因第738位氨基酸的定點修飾片段，所述定點修飾片段用于替換pAPN基因待定點修飾片段；

所述pAPN基因待定點修飾片段位于所述兩個靶位點之間；

所述pAPN基因定點修飾為pAPN基因T738替換為V738。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的產(chǎn)品，其特征在于，編碼所述第一sgRNA為SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的產(chǎn)品，其特征在于，編碼所述第二sgRNA為SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的產(chǎn)品，其特征在于，所述pAPN基因定點修飾為將編碼pAPN基因第738位氨基酸的ACC替換為GTC。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的產(chǎn)品，其特征在于，所述供體DNA為SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。

6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項所述的產(chǎn)品，其特征在于，所述基因編輯蛋白包括Cas9、Cas9n、Cpf1或C2c2。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的產(chǎn)品，其特征在于，所述基因編輯蛋白為Cas9。

8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的產(chǎn)品，其特征在于，所述第一載體和第二載體均獨立地包括pX330、pX260、pX334、pX335、pX458、pX459、pX461、pX462、pX551或pX552。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的產(chǎn)品，其特征在于，所述第一載體和第二載體均獨立地為pX458。

10.權(quán)利要求1-9任一項所述的產(chǎn)品在如下(a)-(c)中的應(yīng)用，所述應(yīng)用為非診斷和治療目的的：

(a)構(gòu)建pAPN基因定點修飾的細(xì)胞系；

(b)制備預(yù)防豬傳染性胃腸炎的產(chǎn)品；

(c)構(gòu)建豬傳染性胃腸炎抗性豬模型。

11.一種非診斷和治療目的的pAPN基因定點修飾的細(xì)胞的制備方法，其特征在于，包括向目的細(xì)胞導(dǎo)入權(quán)利要求1-9任一項所述的產(chǎn)品，得到pAPN基因定點修飾的細(xì)胞。

12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的制備方法，其特征在于，所述目的細(xì)胞為豬成纖維細(xì)胞。

13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的制備方法，其特征在于，所述目的細(xì)胞為豬胎兒成纖維細(xì)胞。

14.根據(jù)權(quán)利要求11所述的制備方法，其特征在于，導(dǎo)入的方法包括電穿孔法或脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法。

15.根據(jù)權(quán)利要求11所述的制備方法，其特征在于，導(dǎo)入操作后通過篩選和鑒定，得到pAPN基因定點修飾的細(xì)胞。

16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的制備方法，其特征在于，所述篩選包括通過流式分選篩選單克隆細(xì)胞。

17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的制備方法，其特征在于，所述鑒定包括測序鑒定。

18.權(quán)利要求11-17任一項所述制備方法得到的細(xì)胞。