[發(fā)明專利]PDCoV全長基因的構(gòu)建方法及引物

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110983935.6
• 申請日: 2021-08-25
• 公開（公告）號: CN113699167A
• 公開（公告）日: 2021-11-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 易宏波;謝永生;王麗;蔣宗勇
• 申請（專利權(quán)）人: 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物科學(xué)研究所
• 主分類號: C12N15/50
• 分類號: C12N15/50;C12N15/11;C12N15/10;C12N15/63;C12Q1/70;C12Q1/686
• 代理公司: 廣州專理知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 44493
• 代理人: 沈素芹

1.一種用于構(gòu)建PDCoV全長基因的引物，其特征在于，包括15組引物對，其序列如SEQID No.1～30所示。

2.一種PDCoV全長基因的構(gòu)建方法，其特征在于，包括將如權(quán)利要求1所述的引物進(jìn)行擴(kuò)增的步驟。

3.如權(quán)利要求2所述的PDCoV全長基因的構(gòu)建方法，其特征在于，包括：

提取PDCoV病毒RNA；

以提取得到的PDCoV病毒RNA為模板，利用如權(quán)利要求1所述的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測序后拼接即得PDCoV全長基因。

4.如權(quán)利要求2所述的PDCoV全長基因的構(gòu)建方法，其特征在于，PCR反應(yīng)體系為：PrimeScript 1Step Enzyme Mix 0.5～1.5μL，2×1Step Buffer 20～28μL，上下游引物各1～3μL，模板2～4μL，RNase-free H₂O 16～20μL；

PCR反應(yīng)條件為：

50～55℃預(yù)變性25～35min；

90～95℃變性15～40s，50～55℃退火20～35s，70～75℃延伸2～3min，重復(fù)30～40個(gè)循環(huán)；

70～75℃延伸10～15min。

5.如權(quán)利要求4所述的PDCoV全長基因的構(gòu)建方法，其特征在于，PCR反應(yīng)體系為：PrimeScript 1Step Enzyme Mix 1μL，2×1Step Buffer 25μL，上下游引物各2μL，模板3μL，RNase-free H₂O 17μL；

PCR反應(yīng)條件為：

50℃預(yù)變性30min；

94℃變性30s，54℃退火30s，72℃延伸2.5min，重復(fù)35個(gè)循環(huán)；

72℃延伸10min。

6.一種用于檢測PDCoV的試劑盒，其特征在于，包括如權(quán)利要求1所述的引物。

7.如權(quán)利要求6所述的用于檢測PDCoV的試劑盒，其特征在于，還包括如權(quán)利要求4或5所述的PCR反應(yīng)體系。

8.一種質(zhì)粒，其特征在于，其由權(quán)利要求1所述的任一引物經(jīng)PCR擴(kuò)增，與載體連接后所得。

9.如權(quán)利要求8所述的重組質(zhì)粒，其特征在于，所述載體為pMD19-T載體。

10.如權(quán)利要求1所述的用于構(gòu)建PDCoV全長基因的引物在制備抗PDCoV疫苗或藥物中的應(yīng)用。