[發明專利]一種草魚魚鱗高活性抗凍多肽及其制備方法

有效

• 申請號: 202110975870.0
• 申請日: 2021-08-24
• 公開（公告）號: CN113717251B
• 公開（公告）日: 2023-06-02
• 發明（設計）人: 黨美珠;李春美;王瑞豐
• 申請（專利權）人: 華中農業大學;河南牧業經濟學院
• 主分類號: C07K7/08
• 分類號: C07K7/08;C12P21/06;C07K1/14
• 代理公司: 鄭州豫開專利代理事務所(普通合伙) 41131
• 代理人: 朱俊峰

1.一種草魚魚鱗高活性抗凍多肽，其特征在于：該抗凍多肽的分子量在1107.54～1554.72Da，所含的三種主要多肽氨基酸序列分別是VGPAGPSGPSGPQ、RGSPGERGESGPAGPSG、VGPAGPSGPSGPQG；

所述抗凍多肽的制備方法為：將草魚魚鱗清洗、曬干后進行粉碎，并進行?45℃超聲清洗?50?分鐘；之后將洗凈的魚鱗過濾干凈，使用?1mol/L?的檸檬酸溶液震蕩浸泡?24h，最后將魚鱗過濾清洗至中性后備用；按照酶采用木瓜蛋白酶，底物草魚魚鱗濃度?5%、pH6、酶解時間?3h、酶解溫度?60℃、加酶量?4000U/g?進行水解，反應結束后，沸水浴?10min?滅酶，收集酶水解的溶液；在?4℃、8000r/min?條件下用冷凍離心機離心?15min，取其上清液；對上清液的酶解產物分離純化的具體操作過程為：酶解產物首先選用凝膠色譜進行分離，第一次分離采用的洗脫液為?pH7.0?的?PBS?緩沖溶液，流速為?0.8mL/min，洗脫峰在?225nm?下進行測量，收集具有最佳抗凍活性的峰；再用陽離子交換色譜進行分離，第二次分離采用的采用洗脫液為?NaCl?濃度為?0-0.5M?的?0.01mol/L?pH5.0?的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，流速為0.5mL/min，收集具有最佳抗凍活性的峰；接著再用?C18?反相?HPLC?進一步分離，最后收集具有最佳抗凍活性的組分。

2.根據權利要求1所述的一種草魚魚鱗高活性抗凍多肽的制備方法，其特征在于：包括以下步驟：

（1）采用草魚魚鱗為原料，先對草魚魚鱗進行處理；

（2）對處理后的草魚魚鱗進行酶解；

（3）分離純化酶解液；

（4）冷凍干燥后得到所述的抗凍多肽；

（5）對抗凍多肽的抗凍活性進行測定；

（6）測定抗凍多肽的氨基酸序列；

步驟（1）-（4）的具體制備過程為：將草魚魚鱗清洗、曬干后進行粉碎，并進行?45℃超聲清洗?50?分鐘；之后將洗凈的魚鱗過濾干凈，使用?1mol/L?的檸檬酸溶液震蕩浸泡?24h，最后將魚鱗過濾清洗至中性后備用；按照酶采用木瓜蛋白酶，底物草魚魚鱗濃度?5%、pH6、酶解時間?3h、酶解溫度?60℃、加酶量?4000U/g?進行水解，反應結束后，沸水浴?10min?滅酶，收集酶水解的溶液；在?4℃、8000r/min?條件下用冷凍離心機離心?15min，取其上清液；對上清液的酶解產物分離純化的具體操作過程為：酶解產物首先選用凝膠色譜進行分離，第一次分離采用的洗脫液為?pH7.0?的?PBS?緩沖溶液，流速為?0.8mL/min，洗脫峰在?225nm下進行測量，收集具有最佳抗凍活性的峰；再用陽離子交換色譜進行分離，第二次分離采用的采用洗脫液為?NaCl?濃度為?0-0.5M?的?0.01mol/L?pH5.0?的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，流速為0.5mL/min，收集具有最佳抗凍活性的峰；接著再用?C18?反相?HPLC?進一步分離，最后收集具有最佳抗凍活性的組分。