[發(fā)明專利]一種利用氧化還原電位調控甲基營養(yǎng)菌生產(chǎn)吡咯喹啉醌的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110967604.3
• 申請日: 2021-08-23
• 公開（公告）號: CN113699194A
• 公開（公告）日: 2021-11-26
• 發(fā)明（設計）人: 柯崇榕;楊欣偉;黃建忠;丁靈濤;任洋;劉孟粟;陶勇
• 申請（專利權）人: 福建師范大學
• 主分類號: C12P17/18
• 分類號: C12P17/18;C12N13/00;C12Q3/00;C12R1/01
• 代理公司: 福州科揚專利事務所(普通合伙) 35001
• 代理人: 李曉芬

本發(fā)明公開一種利用氧化還原電位調控甲基營養(yǎng)菌生產(chǎn)吡咯喹啉醌的方法，包括菌種活化、種子培養(yǎng)和發(fā)酵生產(chǎn)；在甲基營養(yǎng)菌發(fā)酵生產(chǎn)吡咯喹啉醌的體系中引入氧化還原電位電極，通過控制體系中通氣量和攪拌轉速來調節(jié)發(fā)酵生產(chǎn)階段的氧化還原電位在高電位氧化階段和低電位還原階段變化，進而保證菌體生長和吡咯喹啉醌的積累，本發(fā)明的方法能夠縮短發(fā)酵時間，同時提高吡咯喹啉醌的產(chǎn)量和產(chǎn)率及發(fā)酵體系的穩(wěn)定性。

技術領域

本發(fā)明具體涉及一種利用氧化還原電位(ORP)調控甲基營養(yǎng)菌生產(chǎn)吡咯 喹啉醌的方法，屬于發(fā)酵工程技術領域。

背景技術

吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinone，PQQ)是繼NAD⁺/NADP⁺和FMN/FAD 之后發(fā)現(xiàn)的第3種氧化還原酶的輔酶，天然存在于自然界中，是迄今為止發(fā)現(xiàn) 的唯一存在于所有動植物組織中的生物因子。PQQ作為一種獨特的生理活性物 質，在抗衰老、抗疲勞、提高免疫力以及炎癥、肝病和骨質疏松等疾病的治療 或輔助治療方面具有很大的潛力，具有良好的醫(yī)療和保健開發(fā)前景。PQQ對于 哺乳動物自身是不能合成的，只能從食物中攝取，在芹菜、菠菜、青椒、獼猴 桃和木瓜含量較高，特別是在人類母乳中含量高達140-180μg/L。2003年日本 科學家Kasahara在《Nature》發(fā)表論文建議將PQQ歸類為維生素，2018年美國 癌癥與抗衰老專家Bruce N.Ames在PNAS上發(fā)文將PQQ定義為“長壽維生素”。 目前，PQQ在美國、日本和歐盟被歸類為類維生素，作為膳食補充劑進行銷售。

迄今為止，能夠合成PQQ的生物主要是革蘭氏陰性細菌，其中，生絲微菌 的PQQ生物合成水平高，已經(jīng)替代化學合成法，成為PQQ的主要生產(chǎn)方式。 截止2020年12月，共有6家企業(yè)向美國FDA進行NDI認證或GRAS注冊， 其中5家企業(yè)均采用以生絲微菌Hyphomicrobium為生產(chǎn)菌株的微生物發(fā)酵法進 行PQQ的生產(chǎn)合成。目前PQQ的具體生物合成途徑基本闡釋清楚，該過程需 要平衡細胞質中的氧含量，滿足PqqE和PqqC對厭氧微環(huán)境和氧氣的需求，完 成PqqA的縮合和羥基化以及AHQQ的環(huán)化和氧化。工業(yè)上生產(chǎn)PQQ均是采用 補料分批發(fā)酵(CN106282044A、GRN No.641、GRN No.694、GRN No.701和 GRN No.709)或者半連續(xù)發(fā)酵(CN109628509A)，將溶氧控制在5％以上。但 是，上述發(fā)酵工藝存在三個突出的問題：1、前期低溶氧影響菌體生長，造成發(fā) 酵周期長；2、中期供氧不足中間體大量積累，造成碳源轉化率低；3、后期菌 體自溶螯合PQQ，造成單位細胞產(chǎn)率低。申請?zhí)枮镃N201510262476.7的中國專 利公開了一種生絲微菌和吡咯喹啉醌的制備方法，其中具體公開了一種生絲微 菌，采用控氧工藝(DO維持在5％)在80T發(fā)酵罐中培養(yǎng)生絲微菌，從發(fā)酵液 中獲取獲得吡咯喹啉醌，240h的PQQ產(chǎn)量為1.78g/L。因此，根據(jù)PQQ強氧化 還原特性及其獨特的生物合成途徑，建立高效的發(fā)酵生產(chǎn)工藝是提高生絲微菌 工業(yè)化生產(chǎn)PQQ的關鍵。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的在于提供一種利用氧化還原電位(ORP)調控甲基營養(yǎng)菌生 產(chǎn)吡咯喹啉醌的方法，通過三階段ORP控制策略，調節(jié)吡咯喹啉醌的發(fā)酵過程， 從而提高吡咯喹啉醌的產(chǎn)量和產(chǎn)率及發(fā)酵體系的穩(wěn)定性，縮短發(fā)酵時間。

本發(fā)明的技術方案如下：

本發(fā)明的目的在于一種利用氧化還原電位調控甲基營養(yǎng)菌生產(chǎn)吡咯喹 啉醌的方法，包括菌種活化、種子培養(yǎng)和發(fā)酵生產(chǎn)；在甲基營養(yǎng)菌發(fā)酵生產(chǎn)吡 咯喹啉醌的體系中引入氧化還原電位電極，通過控制體系中通氣量和攪拌轉速 來調節(jié)發(fā)酵生產(chǎn)階段的氧化還原電位在高電位氧化階段和低電位還原階段變 化，進而保證菌體生長和吡咯喹啉醌的積累。

進一步的，所述發(fā)酵生產(chǎn)中引入氧化還原電位電極后設置三階段控制發(fā)酵 過程，所述氧化還原電位維持在190～250mV范圍內，其中，第一階段為發(fā)酵開 始至35～60h內，為高電位強氧化階段；第二階段發(fā)酵開始后的35～60h至70～100h 內，為低電位強還原階段；第三階段為發(fā)酵開始后的70～100h至150～200h之后， 為中和階段。