[發(fā)明專利]一種染色方法、試劑盒及應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110963181.8
• 申請(qǐng)日: 2021-08-20
• 公開（公告）號(hào): CN113607534B
• 公開（公告）日: 2022-10-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 邢雅南;李三華;米貫勛;趙琳琳;張林姿;牛銀銀;劉文弟;齊華;劉暢
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 河南賽諾特生物技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): G01N1/31
• 分類號(hào): G01N1/31;G01N33/532
• 代理公司: 鄭州睿信知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 41119
• 代理人: 郭佳效

1.一種染色方法，其特征在于，包括如下步驟：

1）液基薄層細(xì)胞制片：使用液基薄層細(xì)胞制片方法制備細(xì)胞涂片；

2）固定：清洗液沖洗細(xì)胞涂片，在樣本區(qū)域滴加固定劑室溫固定；所述固定劑由95%乙醇、冰醋酸、丙酮組成，其中，95%乙醇、冰醋酸、丙酮的體積比0.9：0.1：（0.01-0.03）；

3）細(xì)胞通透：清洗液沖洗細(xì)胞涂片，采用通透劑處理細(xì)胞涂片；所述通透劑為通透劑Ⅰ和通透劑Ⅱ兩種試劑，所述通透劑Ⅰ為0.25%-0.5%胰酶溶液；所述通透劑Ⅱ?yàn)?.2%-0.4%胃酶溶液；

4）免疫細(xì)胞化學(xué)染色：采用P16^INK4a抗體對(duì)通透處理后的細(xì)胞涂片進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色；

5）巴氏染色：對(duì)步驟4）已經(jīng)完成免疫細(xì)胞化學(xué)染色的細(xì)胞涂片先采用橘黃G染色液染色，漂洗后采用EA50染色液染色；

6）脫水、透明、封片；

步驟1）中采用宮頸脫落細(xì)胞樣本進(jìn)行液基薄層細(xì)胞制片；

步驟3）中采用通透劑處理細(xì)胞涂片包括如下步驟：先在樣本區(qū)域滴加通透劑Ⅰ并孵育，清洗液沖洗，再在樣本區(qū)域滴加通透劑Ⅱ并孵育，或先在樣本區(qū)域滴加通透劑Ⅱ并孵育，清洗液沖洗，再在樣本區(qū)域滴加通透劑Ⅰ并孵育。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2）中，固定的時(shí)間為5min。

3.根據(jù)權(quán)利要求1~2中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，步驟4）中免疫細(xì)胞化學(xué)染色包括如下步驟：

① 加過氧化物酶封閉劑：清洗液沖洗細(xì)胞涂片，在樣本區(qū)域滴加內(nèi)源性過氧化物酶封閉劑，室溫下孵育5min；

② 一抗孵育：清洗液沖洗細(xì)胞涂片，在樣本區(qū)域滴加P16^INK4a抗體，于37℃孵育60min；

③ 一抗后孵育：清洗液沖洗細(xì)胞涂片，在樣本區(qū)域滴加一抗后試劑Linker，于37℃孵育20min；

④ 二抗孵育：清洗液沖洗細(xì)胞涂片，在樣本區(qū)域滴加酶標(biāo)二抗聚合物試劑，于37℃孵育30min；

⑤ 顯色：清洗液沖洗細(xì)胞涂片，在樣本區(qū)域滴加DAB顯色液，室溫孵育3-8min；

⑥ 蘇木素復(fù)染：純水沖洗細(xì)胞涂片，在樣本區(qū)域滴加蘇木素復(fù)染。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟5）中巴氏染色包括如下步驟：將已經(jīng)完成免疫細(xì)胞化學(xué)染色的細(xì)胞涂片置于95%乙醇中漂洗2次，每次10s，然后置于巴氏染色液橘黃G染色液中1min，95%乙醇中漂洗2次，每次10s，然后置于EA50染色液中2.5min，95%乙醇中漂洗2次，每次10 s。

5.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的方法，其特征在于，步驟5）之前還包括如下步驟：對(duì)步驟4）已經(jīng)完成免疫細(xì)胞化學(xué)染色的細(xì)胞涂片進(jìn)行脫水透明并用中性樹膠封片，而后進(jìn)行褪片脫膠。

6.一種用于實(shí)施權(quán)利要求1所述染色方法的輔助宮頸鱗狀上皮細(xì)胞染色的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括固定劑和通透劑，所述固定劑由95%乙醇、冰醋酸、丙酮組成，其中，95%乙醇、冰醋酸、丙酮的體積比0.9：0.1：（0.01-0.03）；所述通透劑為通透劑Ⅰ和通透劑Ⅱ兩種試劑，所述通透劑Ⅰ為0.25%-0.5%胰酶溶液；所述通透劑Ⅱ?yàn)?.2%-0.4%胃酶溶液。

7.一種用于實(shí)施權(quán)利要求1所述染色方法的宮頸鱗狀上皮細(xì)胞染色試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括固定劑、通透劑、過氧化物酶封閉劑、P16^INK4a抗體、酶標(biāo)羊抗鼠/兔聚合物、DAB顯色底物、DAB顯色緩沖液、蘇木素復(fù)染液、橘黃G染色液和EA50染色液；其中，所述固定劑由95%乙醇、冰醋酸、丙酮組成，其中，95%乙醇、冰醋酸、丙酮的體積比0.9：0.1：（0.01-0.03）；所述通透劑為通透劑Ⅰ和通透劑Ⅱ兩種試劑，所述通透劑Ⅰ為0.25%-0.5%胰酶溶液；所述通透劑Ⅱ?yàn)?.2-0.4%胃酶溶液。

8.如權(quán)利要求6或7所述的試劑盒在P16^INK4a免疫細(xì)胞化學(xué)染色與巴氏染色聯(lián)合染色方面的應(yīng)用。