[發(fā)明專利]一種基于CRSIPR-Cas體系的快速檢測沙門氏菌的試劑盒及方法

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• 申請日: 2021-08-20
• 公開（公告）號: CN113801920A
• 公開（公告）日: 2021-12-17
• 發(fā)明（設計）人: 沈興;劉莉;張旭;蓋作啟;王宏
• 申請（專利權）人: 廣州艾迪基因科技有限責任公司
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844;C12Q1/689;C12Q1/10;C12R1/42
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 趙崇楊

本發(fā)明公開了一種基于CRSIPR?Cas體系的快速檢測沙門氏菌的試劑盒及方法。先對待測樣品進行RPA擴增，再在crRNA探針介導下，利用CRISPR?Cas12a體系對RPA擴增產物進行裂解反應，得到信號產物，最后通過信號產物的顯色檢測進行判斷。本發(fā)明的檢測沙門氏菌的RPA?CRISPR/cas12a技術，通過RPA擴增及crRNA識別雙重特異對沙門氏菌進行檢測，特異性強，且靈敏度可低至在10^?4ng/μL或10²CFU/mL，與qPCR儀器方法相當。本發(fā)明檢測時間短，靈敏度高，無需大型儀器，只需一個恒溫裝置和可攜帶熒光裝置，37℃即可完成全部反應，適用于現(xiàn)場的快速檢測，具有較好的應用前景。

技術領域

本發(fā)明涉及食源性致病菌檢測技術領域，更具體地，涉及一種基于CRSIPR-Cas體系的快速檢測沙門氏菌的試劑盒及方法。

背景技術

沙門氏菌是一種兼性厭氧的細菌，屬腸桿菌科，是革蘭氏陰性腸道桿菌。沙門氏菌與其他食源性致病菌如：彎曲桿菌，單增生李斯特菌，金黃色葡萄球菌，產志賀毒素的大腸桿菌等均是導致大量食源性病例的常見細菌。據(jù)統(tǒng)計，食品安全事件中細菌性食物中毒事件高達40％，且沙門氏菌引起的中毒事件高居首位。沙門氏菌通常會污染的食物主要有蛋制品，乳制品，肉制品，水生動物也會因水質受到污染而被感染，對人類的健康安全造成極大危害。感染沙門氏菌的臨床癥狀常表現(xiàn)為腹痛，頭痛惡心，嘔吐，腹瀉等，嚴重者會危及生命。

在GB29921-2013《食品安全國家標準食品中致病菌限量》所列出的所有食品類別中，無論是肉制品，糧食制品，飲料，還是即食豆制品，即食果蔬制品，沙門氏菌的限量標準均是一致的，即同一批次采集的5個樣品中，沙門氏菌不得檢出(n＝5，c＝0)。國際食品微生物標準委員會、歐盟、國際食品法典委員會對各類食品分別做了不同要求，總體上比我國更為嚴格，有些甚至能達到n＝60，c＝0。因此，沙門氏菌的危害性可見一斑，沙門氏菌的快速檢測也一直都是食品安全中的研究重點之一。

我國現(xiàn)行的沙門氏菌檢驗標準為GB4789.4-2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗沙門氏菌檢驗》。該法為最基礎最標準的沙門氏菌檢驗方法，其準確度高，穩(wěn)定性好，成本低，但其操作復雜，耗時長，需要耗費大量的人力物力。因此，各種快速檢測沙門氏菌的技術和方法應運而生，包括基于免疫學的方法，如酶聯(lián)免疫吸附法和側流免疫層析法；基于傳感器以及適配體的生物技術，如光學生物傳感器，電化學生物傳感器；基于核酸序列的方法，如PCR，實時熒光定量PCR(qPCR)等。目前各種方法均有各自的局限性，其中基于DNA的分子生物學檢測方法因其具有靈敏度高、特異性強、成本低等優(yōu)點而應用較為廣泛。但目前的分子生物學方法對檢測人員、樣品DNA質量、檢測環(huán)境要求高，且PCR和qPCR儀價格昂貴，多用于實驗室，較難應用到現(xiàn)場快速檢測。因此，建立一種同時滿足快速、便捷且靈敏度高的沙門氏菌檢測方法至關重要，能夠為食品安全和人們健康帶來保障。

中國專利CN111961705A公開了一種沙門氏菌的檢測方法，是以待測樣品的核酸為模板，利用沙門氏菌特異性引物使用環(huán)介導等溫擴增技術(LAMP)進行擴增，得到擴增產物；再在特異crRNA的介導下，利用CRISPR系統(tǒng)對所得到的擴增產物進行裂解反應，得到裂解產物；最后將得到的裂解產物使用膠體金試紙條進行顯色檢測；其LAMP擴增時間為1h，且需要65℃，檢測時間較長、檢測溫度較高，同時膠體金檢測結果不穩(wěn)定且需要額外的耗材。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術中存在的上述缺陷和不足，提供一種基于CRSIPR-Cas體系的快速沙門氏菌檢測方法。先通過對待測樣品核酸模板進行恒溫擴增反應得到擴增產物，再在特異crRNA的介導下，利用含ssDNA熒光探針的CRISPR-Cas12a體系對RPA擴增產物進行裂解反應，得到信號產物，最后通過信號產物的顯色檢測進行判斷，簡單快捷。

本發(fā)明的第一目的在于提供一種快速檢測沙門氏菌的RPA引物和crRNA探針。

本發(fā)明的第二個目的在于提供一種快速檢測沙門氏菌的方法。