[發(fā)明專利]一種海洋鏈霉菌磷脂酶D突變體及其重組表達(dá)菌株的制備方法有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 202110962378.X | 申請日： | 2021-08-20 |
| 公開（公告）號： | CN113801862B | 公開（公告）日： | 2023-06-20 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 王永華;胡榮康;王方華;藍(lán)東明;崔瑞國;楊博 | 申請（專利權(quán)）人： | 華南理工大學(xué) |
| 主分類號： | C12N9/16 | 分類號： | C12N9/16;C12N15/55;C12N1/21;C12N15/70;C12P7/6481;C12P13/06;C12R1/19 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 海洋 霉菌 磷脂酶 突變體 及其 重組 表達(dá) 菌株 制備 方法 | ||
本發(fā)明公開了一種海洋鏈霉菌磷脂酶D突變體及其重組表達(dá)菌株的制備方法，所述的磷脂酶D突變體是在氨基酸序列為SEQ?ID?NO:1的親本序列基礎(chǔ)上發(fā)生如下突變：P343A；或Y383L；或P343A，Y383L；或P343A，Y383L，S380V，其對應(yīng)的氨基酸序列為SEQIDNO:2，SEQID?NO:3，SEQID?NO:4，SEQID?NO:5。相比于野生型，本發(fā)明突變體1的酶活力是野生型的1.3倍，突變體2的酶活是野生型的1.46倍，突變體3的酶活是野生型的3.9倍，突變體4的酶活是野生型的11.6倍。本發(fā)明獲得的磷脂酶突變體活力得到顯著提高。
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于酶的基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說涉及利用分子生物學(xué)定點(diǎn)突變技術(shù)獲得催化性能顯著提高的磷脂酶D突變體及其重組表達(dá)制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)
磷脂是一種含有磷酸的混合脂類，是生物膜的基本成分和組成生命的必需物質(zhì)。此外，磷脂由于其獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)和保健功能，已廣泛應(yīng)用于乳化劑、化妝品成分、醫(yī)藥配方和脂質(zhì)體制劑。在工業(yè)中，天然磷脂主要是毛油精煉脫水和脫膠的副產(chǎn)品。近年來，人們對不同分子性質(zhì)如電荷、極性、大小等的磷脂產(chǎn)生了極大的興趣，以獲得具有優(yōu)良加工性能和突出生理藥理功能的特殊功能磷脂。因此，對天然磷脂進(jìn)行改性已成為實(shí)現(xiàn)磷脂副產(chǎn)物高價值利用的重要途徑。
酶法修飾改性是制備功能性磷脂的一個重要方向。作為磷脂酶家族的重要成員，磷脂酶D(PLD)是合成和改造磷脂質(zhì)的一類重要工具酶。磷脂酶D(PLD)(EC?3.1.4.4)可通過磷脂酰基轉(zhuǎn)移作用(transphosphatidylation)催化磷脂質(zhì)極性頭部基團(tuán)發(fā)生轉(zhuǎn)移反應(yīng)，從而合成為各種不同的稀有磷脂及系列功能性磷脂衍生物。PLD已被用于合成較少豐富的磷脂，如磷脂酰甘油(phosphatidylglycerol，PG)，磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine，PE)，磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)和磷脂酰肌醇(phatidylglycerol，PI)。除此之外，通過PLD還合成了大量新型磷脂，其中包括磷脂酰膽堿(phosphatidylcholine，PC)中的膽堿被脂族醇、糖類，核苷、芳香醇或n-雜環(huán)醇所取代。盡管PLD可以用于合成大量磷脂，磷脂酶D來源單一、酶活力低下、制備難度大、成本高是當(dāng)前制約該類酶開發(fā)的技術(shù)瓶頸，其中酶活力低下成為主要的制約因素，離工業(yè)化應(yīng)用的需求還有很大的差距。利用蛋白質(zhì)工程對酶分子進(jìn)行改造成為解決該問題的主要方案，如中國發(fā)明專利201610402557.7中利用重組DNA技術(shù)對野生型磷脂酶D基因進(jìn)行定點(diǎn)突變，得到活力較高的磷脂酶D基因。重組表達(dá)后，檢測高活力磷脂酶D的比酶活較野生型磷脂酶D提高38-140％。酶分子體外定向進(jìn)化屬于蛋白質(zhì)的非理性設(shè)計，屬于蛋白質(zhì)工程的范疇。通常手段是利用分子生物學(xué)手段在分子水平創(chuàng)造出分子的多樣性，結(jié)合靈敏、高通量的篩選技術(shù)，
從而能夠在短時間內(nèi)得到理想的突變體。通過合理設(shè)計改造酶基因可以提高PLDs的催化性能。
發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，本發(fā)明提供一種高活力磷脂酶D。
SEQ?ID?No.1
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