[發明專利]一種海洋鏈霉菌磷脂酶D突變體及其重組表達菌株的制備方法

有效

• 申請號: 202110962378.X
• 申請日: 2021-08-20
• 公開（公告）號: CN113801862B
• 公開（公告）日: 2023-06-20
• 發明（設計）人: 王永華;胡榮康;王方華;藍東明;崔瑞國;楊博
• 申請（專利權）人: 華南理工大學
• 主分類號: C12N9/16
• 分類號: C12N9/16;C12N15/55;C12N1/21;C12N15/70;C12P7/6481;C12P13/06;C12R1/19
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 宮愛鵬

本發明公開了一種海洋鏈霉菌磷脂酶D突變體及其重組表達菌株的制備方法，所述的磷脂酶D突變體是在氨基酸序列為SEQ?ID?NO:1的親本序列基礎上發生如下突變：P343A；或Y383L；或P343A，Y383L；或P343A，Y383L，S380V，其對應的氨基酸序列為SEQIDNO:2，SEQID?NO:3，SEQID?NO:4，SEQID?NO:5。相比于野生型，本發明突變體1的酶活力是野生型的1.3倍，突變體2的酶活是野生型的1.46倍，突變體3的酶活是野生型的3.9倍，突變體4的酶活是野生型的11.6倍。本發明獲得的磷脂酶突變體活力得到顯著提高。

技術領域

本發明屬于酶的基因工程技術領域，具體地說涉及利用分子生物學定點突變技術獲得催化性能顯著提高的磷脂酶D突變體及其重組表達制備方法和應用。

背景技術

磷脂是一種含有磷酸的混合脂類，是生物膜的基本成分和組成生命的必需物質。此外，磷脂由于其獨特的化學結構和保健功能，已廣泛應用于乳化劑、化妝品成分、醫藥配方和脂質體制劑。在工業中，天然磷脂主要是毛油精煉脫水和脫膠的副產品。近年來，人們對不同分子性質如電荷、極性、大小等的磷脂產生了極大的興趣，以獲得具有優良加工性能和突出生理藥理功能的特殊功能磷脂。因此，對天然磷脂進行改性已成為實現磷脂副產物高價值利用的重要途徑。

酶法修飾改性是制備功能性磷脂的一個重要方向。作為磷脂酶家族的重要成員，磷脂酶D(PLD)是合成和改造磷脂質的一類重要工具酶。磷脂酶D(PLD)(EC?3.1.4.4)可通過磷脂酰基轉移作用(transphosphatidylation)催化磷脂質極性頭部基團發生轉移反應，從而合成為各種不同的稀有磷脂及系列功能性磷脂衍生物。PLD已被用于合成較少豐富的磷脂，如磷脂酰甘油(phosphatidylglycerol，PG)，磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine，PE)，磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)和磷脂酰肌醇(phatidylglycerol，PI)。除此之外，通過PLD還合成了大量新型磷脂，其中包括磷脂酰膽堿(phosphatidylcholine，PC)中的膽堿被脂族醇、糖類，核苷、芳香醇或n-雜環醇所取代。盡管PLD可以用于合成大量磷脂，磷脂酶D來源單一、酶活力低下、制備難度大、成本高是當前制約該類酶開發的技術瓶頸，其中酶活力低下成為主要的制約因素，離工業化應用的需求還有很大的差距。利用蛋白質工程對酶分子進行改造成為解決該問題的主要方案，如中國發明專利201610402557.7中利用重組DNA技術對野生型磷脂酶D基因進行定點突變，得到活力較高的磷脂酶D基因。重組表達后，檢測高活力磷脂酶D的比酶活較野生型磷脂酶D提高38-140％。酶分子體外定向進化屬于蛋白質的非理性設計，屬于蛋白質工程的范疇。通常手段是利用分子生物學手段在分子水平創造出分子的多樣性，結合靈敏、高通量的篩選技術，

從而能夠在短時間內得到理想的突變體。通過合理設計改造酶基因可以提高PLDs的催化性能。

發明內容

為了克服現有技術存在的缺陷，本發明提供一種高活力磷脂酶D。

SEQ?ID?No.1