[發明專利]一種天然組織來源的骺軟骨聯合骨脫細胞材料的制備方法在審
| 申請號： | 202110962367.1 | 申請日： | 2021-08-20 |
| 公開（公告）號： | CN113577391A | 公開（公告）日： | 2021-11-02 |
| 發明（設計）人： | 林賢豐;張琪;范順武 | 申請（專利權）人： | 浙江大學醫學院附屬邵逸夫醫院 |
| 主分類號： | A61L27/36 | 分類號： | A61L27/36;A61L27/50 |
| 代理公司： | 北京慕達星云知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11465 | 代理人： | 崔自京 |
| 地址： | 310000 浙江省杭州市*** | 國省代碼： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 天然 組織 來源 軟骨 聯合 細胞 材料 制備 方法 | ||
1.一種天然組織來源的骺軟骨聯合骨脫細胞材料的制備方法，其特征在于，具體步驟如下：
(1)取新鮮3-4月齡大白豬股骨遠端骺軟骨聯合骨組織，在4℃低溫環境下用無菌PBS反復漂洗5次，每次10min；
(2)在有機溶劑中，置于恒溫25℃、轉速為60rpm的恒溫搖床中震蕩脫脂2-6h；后用無菌PBS沖洗12h；所述有機溶劑為質量濃度為50-70％乙醇溶液或20-40％丙酮溶液；
(3)置于液氮30min后，再迅速取出放置于37℃水浴30min；重復3次；最后用無菌PBS漂洗2次，每次5min；
(4)在體積濃度為1-2％的含Triton X-100的PBS緩沖液中加入混合抗菌溶液，置于恒溫25℃、轉速為100rpm的恒溫搖床中震蕩24-72h；再用無菌PBS沖洗12h；
(5)在質量濃度為2-5％的含十二烷基醚硫酸鈉磺酸的PBS緩沖液中加入混合抗菌溶液，置于恒溫25℃、轉速為100rpm的恒溫搖床中震蕩12-48h；再用無菌PBS沖洗12h；
(6)在質量濃度為1-2％的3-烯丙氧基-2-羥基-1-丙烷磺酸鈉鹽的PBS緩沖液中加入混合抗菌溶液，置于恒溫25℃、轉速為100rpm的恒溫搖床中震蕩6-12h；再用無菌PBS沖洗12h；
(7)在濃度為0.01mg/ml DNaseⅠ的PBS緩沖液中，加入混合抗菌溶液，37℃恒溫水浴6-12h；
(8)在質量濃度為50-70％的乙醇中，置于恒溫25℃、轉速為120rpm的恒溫搖床中震蕩24-48h；
(9)在無菌生理鹽水中，加入混合抗菌溶液，置于溫度為37℃、轉速為120rpm的恒溫搖床中震蕩12h，重復3次；得到天然組織來源的骺軟骨聯合骨脫細胞材料；
步驟(4)-(7)中，所述混合抗菌溶液中青霉素和鏈霉素的濃度分別為100U/ml，100μg/ml；青霉素和鏈霉素的體積比為1:1；PBS緩沖液和混合抗菌溶液的體積比為10:1；
步驟(9)中，所述混合抗菌溶液中青霉素和鏈霉素的濃度分別為100U/ml，100μg/ml；青霉素和鏈霉素的體積比為1:1；無菌生理鹽水和混合抗菌溶液的體積比為10:1。
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