[發明專利]一種ddPCR檢測包蟲病的擴增引物及其構建方法、應用

有效

• 申請號: 202110962259.4
• 申請日: 2021-08-20
• 公開（公告）號: CN113637774B
• 公開（公告）日: 2023-09-19
• 發明（設計）人: 曾勇;袁克非;廖明恒;楊耀玲;徐琳;馮旭萍
• 申請（專利權）人: 四川大學華西醫院
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 成都云縱知識產權代理事務所(普通合伙) 51316
• 代理人: 劉沙粒;伍星

ddPCR檢測肝包蟲病的引物構建方法、擴增引物及其應用，該方法包括以下步驟：篩選細粒棘球絳蟲和多房棘球絳蟲的共同基因片段，基于共同基因片段設計多個第一引物；采用第一引物擴增第一病患組的血漿cfDNA樣本，將能夠擴增第一病患組的血漿cfDNA樣本的第一引物作為第二引物；采用反應體系包括第二引物的ddPCR檢測第二病患組的血漿cfDNA樣本，篩選出陽性檢出率大于預設值的第二引物作為目標擴增引物。本發明得到的擴增引物能夠擴增釋放進入外周血液中的以血漿游離DNA的形式存在的棘球絳蟲的DNA片段，結合ddPCR方法能夠通過檢測人體血漿診斷是否感染包蟲病，實現了細粒棘球絳蟲與多房棘球絳蟲的超早期診斷，為研發包蟲病精準療法提供了足夠靈敏的檢測工具。

技術領域

本發明涉及包蟲病診斷領域，具體涉及一種基于微滴數字PCR檢測外周血的肝包蟲病的擴增引物的構建方法，以及通過該方法篩選得到的擴增引物及其應用。

背景技術

包蟲病，又稱棘球蚴病，是因棘球絳蟲幼蟲寄生于人或動物體內，引起的一種人獸共患的寄生蟲病。包蟲病的感染可導致肝、肺、腦及骨骼等器官和組織的損害，病人喪失勞動能力，是部分農牧區群眾因病致貧、因病返貧的主要原因之一。

中國的包蟲病主要包括囊型包蟲病(cystic?echinococcosis,CE)和泡型包蟲病(alveolar?echinococcosis,AE)，其中，囊型包蟲病由細粒棘球絳蟲(Echinococcosisgranulosus,Eg)的幼蟲棘球蚴寄生人體組織器官所致，而泡型包蟲病由多房棘球絳蟲(Echinococcosis?multilocularis,Em)的幼蟲泡球蚴寄生所致。

為了實現包蟲病的可防、可控、可治的目標，需要在傳染源、傳播途徑、疾病早期階段進行全面布控，積極篩查早期感染病例。但是，棘球蚴因其獨特的病理特點、疾病軌跡，早期診斷十分困難，現有診斷方法的精度和準確度難以滿足早診斷、早治療的需求。

傳統的包蟲病診斷方法中，B超、CT等影像技術以及病理檢查因自身限制，容易造成小病灶、非典型病灶的誤診、漏診和分型困難。血清篩查缺乏有效手段，ELISA，IHA和dot-ELISA等免疫學檢測敏感性較低，不適用于人群篩查及隨訪。專利CN107164479A公開了一種用于檢測和鑒定人組織包蟲病病原的引物對組合及試劑盒，其基于細粒棘球絳蟲和多房棘球絳蟲已知的數個基因型設計多重PCR引物，采用多重PCR方法檢測和鑒定三種人包蟲病病原；專利CN109762910A提供了一種用于同時檢測兩型包蟲病的引物及試劑盒，能夠實現通過單管PCR擴增即可對三個棘球絳蟲種單獨或混合感染引起的兩型包蟲病進行診斷和鑒別。

但是，現有的包蟲病檢測試劑盒的引物主要擴增人體的病灶組織的DNA，這類試劑盒及擴增引物的僅能檢測出病灶中的包蟲病病原體，無法在包蟲對人體造成不可逆的影響前發現病灶，查出的包蟲病人均出現了不可逆的器官損傷，故亦無法滿足早診斷、早治療的需求。

發明內容

本發明的一個目的在于提供一種基于微滴數字PCR(droplet?digital?PCR,ddPCR)檢測肝包蟲病的擴增引物的構建方法，通過該構建方法得到的擴增引物能夠擴增釋放進入外周血液中的血漿游離DNA(cell-free?DNA,cfDNA)，之后利用ddPCR檢測血漿樣本中拷貝數即可判斷樣本是否為陽性，解決了現有技術中僅能檢測病灶組織而造成的無法實現早診斷的問題，實現了細粒棘球絳蟲與多房棘球絳蟲的超早期診斷，可有效地縮短藥物治療效果段判斷期，為研發包蟲病精準療法提供了足夠靈敏的檢測工具。

具體地，該目的通過下述技術方案實現：

一種ddPCR檢測包蟲病的擴增引物的構建方法，該方法具體包括以下步驟：

(A)篩選細粒棘球絳蟲和多房棘球絳蟲的共同基因片段，基于所述共同基因片段設計多個第一引物；