[發明專利]豬圓環病毒4型Cap蛋白單克隆抗體及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 202110961315.2
• 申請日: 2021-08-20
• 公開（公告）號: CN113637069A
• 公開（公告）日: 2021-11-12
• 發明（設計）人: 何召慶;朱曉瑋;唐青海;周永銀;尹秀鳳;王婷;高云飛;顧玉美;吳曉;張淵魁
• 申請（專利權）人: 兆豐華生物科技（南京）有限公司
• 主分類號: C07K16/08
• 分類號: C07K16/08;C07K14/01;G01N33/577;G01N33/569
• 代理公司: 常州佰業騰飛專利代理事務所(普通合伙) 32231
• 代理人: 張紅艷

1.一種豬圓環病毒4型Cap蛋白單克隆抗體，其特征在于：制備所述單克隆抗體所用的免疫原為豬圓環病毒4型Cap蛋白形成的病毒樣顆粒；

所述豬圓環病毒4型Cap蛋白包括3個核心抗原表位，分別為表位1：RRRSRWRRKNGIFHARFMREVTLSVSSFST，如SEQ ID NO：3所示；表位2：NAYYRIRKIKVEFLPLI，如SEQ ID NO：4所示；表位3：SIQNSNFVQVWTVRFTL，如SEQ ID NO：5所示。

2.根據權利要求1所述的豬圓環病毒4型Cap蛋白單克隆抗體，其特征在于：所述單克隆抗體的免疫球蛋白類型包括單克隆抗體3E6、4A7和6D5；其中，單克隆抗體3E6為IgG2b亞型，單克隆抗體4A7和6D5均為IgG1亞型，輕鏈類型均為κ。

3.根據權利要求2所述的豬圓環病毒4型Cap蛋白單克隆抗體，其特征在于：單克隆抗體6D5的輕鏈可變區的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。

4.權利要求1-3任一所述豬圓環病毒4型Cap蛋白單克隆抗體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)免疫程序

將純化的豬圓環病毒4型Cap蛋白形成的病毒樣顆粒與等體積的弗氏完全佐劑乳化，對6～8周齡BALB/c小鼠進行腹腔多點注射，免疫劑量100μg/只；14d后將純化的豬圓環病毒4型Cap蛋白形成的病毒樣顆粒蛋白與弗氏不完全佐劑乳化后進行免疫；細胞融合前3d加強免疫，腹腔注射500μg純化的重組豬圓環病毒4型Cap蛋白；

(2)雜交瘤細胞融合

采用PEG1450將SP2/0細胞與脾細胞進行融合，按1：5～1：2比例取脾細胞和SP2/0骨髓瘤細胞混合，離心后棄上清；緩慢加入50％PEG1400進行融合；用1％的HAT選擇培養基重懸融合細胞，加至96孔細胞培養板中，置37℃、5％CO₂培養箱培養，每天觀察細胞生長情況；采用間接ELISA方法進行MAb篩選，選取僅與豬圓環病毒4型Cap蛋白呈陽性反應的雜交瘤細胞進行細胞克隆純化；

(3)單克隆抗體腹水的制備

取10周齡健康BALB/c小鼠，腹腔注射滅菌液體石蠟0.5mL/只，7～14d后腹腔注射0.5mL雜交瘤細胞5×10⁵～1×10⁶個/只，待小鼠腹部明顯增大時抽取腹水，離心去除油脂和沉淀后即為單克隆抗體腹水。

5.權利要求1-3任一所述豬圓環病毒4型Cap蛋白單克隆抗體在PCV4病毒樣顆粒定量中的應用，其特征在于：基于單克隆抗體6D5，建立單分子成像酶聯免疫吸附試驗iELISA方法，用于定量檢測目的蛋白質。

6.根據權利要求5所述的豬圓環病毒4型Cap蛋白單克隆抗體在PCV4病毒樣顆粒定量中的應用，其特征在于，單分子成像酶聯免疫吸附試驗iELISA方法的核心溶液的使用方法為：(1)鏈霉親和素溶液工作濃度為0.1-0.3mg/mL；(2)生物素化的山羊抗鼠二級抗體溶液工作濃度為20-30ng/mL；(3)抗PCV4 Cap蛋白VLP的小鼠單克隆抗體6D5單抗溶液工作濃度為10-30ng/mL；(4)兔抗PCV4 Cap蛋白VLP的多克隆抗體工作濃度為20-30ng/mL；(5)FITC標記的山羊抗兔二級抗體溶液工作濃度為0.5-2ng/mL。