[發明專利]基于非標記探針熔解技術檢測CYP2D6基因拷貝數的方法、引物對與非標記探針組合及試劑盒

在審

• 申請號: 202110957655.8
• 申請日: 2021-08-20
• 公開（公告）號: CN113684259A
• 公開（公告）日: 2021-11-23
• 發明（設計）人: 戴鵬高;劉金輝;王會娟;顏樺;李剛;陳超
• 申請（專利權）人: 陜西佰美基因股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 西安智邦專利商標代理有限公司 61211
• 代理人: 汪海艷

1.一種基于非標記探針熔解技術檢測CYP2D6基因拷貝數的方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟1、設計非標記探針、上游引物和生物素標記下游引物；

根據人CYP2D6基因以及CYP2D8P基因的序列特點，設計非標記探針、上游引物和生物素標記下游引物；

步驟2、獲取待測樣本的基因組DNA；

步驟3、配制反應體系；

在同一反應體系中加入待測樣本的基因組DNA、上游引物、生物素標記下游引物、DNA聚合酶，dNTPs脫氧核糖核苷三磷酸以及PCR Buffer；

步驟4、進行PCR反應；

將配制好的反應體系置于PCR儀進行PCR反應，實現基因擴增；

步驟5、獲取單鏈PCR產物；

吸附帶有生物素標記的雙鏈PCR產物，并通過誘導DNA變性，分離得到帶有生物素標記的單鏈PCR產物；

步驟6、分析熔解曲線并判定CYP2D6基因的拷貝數；

將單鏈PCR產物、非標記探針和雙鏈熒光染料混合孵育，進行溶解反應，繪制溶解曲線，進行熔解曲線分析；

根據熔解曲線中CYP2D6基因和CYP2D8P基因產物熔解峰的熒光強度比值，判定待測樣本CYP2D6基因的拷貝數。

2.根據權利要求1所述的基于非標記探針熔解技術檢測CYP2D6基因拷貝數的方法，其特征在于：

步驟1中的生物素標記下游引物、上游引物及非標記探針如下：

5’-生物素標記下游引物(18nt)：

5’-生物素-CCTGTACCCTTCCTCCCT-3’

上游引物(18nt)：

5’-TGGTGGCTGACCTGTTCT-3’

非標記探針(20nt)：

5’-TGATCCTACATCCGGATGTG-spacer-3’。

3.根據權利要求2所述的基于非標記探針熔解技術檢測CYP2D6基因拷貝數的方法，其特征在于：所述非標記探針中的spacer選自C3 spacer、C6 spacer、Spacer9、Spacer18或PCsapcer中的一種。

4.根據權利要求1-3任一所述的基于非標記探針熔解技術檢測CYP2D6基因拷貝數的方法，其特征在于：步驟6根據下式判定待測樣本CYP2D6基因的拷貝數：

CYP2D8P熔解峰熒光值/CYP2D6熔解峰熒光值＝K·(CYP2D8P拷貝數/CYP2D6拷貝數)，其中K是一個常數。

5.根據權利要求4所述的基于非標記探針熔解技術檢測CYP2D6基因拷貝數的方法，其特征在于：

若待測樣本的CYP2D8P熔解峰熒光值/CYP2D6熔解峰熒光值在1.31～1.51之間，則該待測樣本的CYP2D6基因拷貝數為1；

若待測樣本的CYP2D8P熔解峰熒光值/CYP2D6熔解峰熒光值在0.91～1.20之間，則該待測樣本的CYP2D6基因拷貝數為2；

若待測樣本CYP2D6熔解峰缺失，僅存在CYP2D8P熔解峰，則該待測樣本的CYP2D6基因拷貝數為0。

6.根據權利要求4所述的基于非標記探針熔解技術檢測CYP2D6基因拷貝數的方法，其特征在于：步驟5中利用鏈霉親和素標記的磁珠吸附帶有生物素標記的雙鏈PCR產物。

7.根據權利要求6所述的基于非標記探針熔解技術檢測CYP2D6基因拷貝數的方法，其特征在于，步驟3中以單管反應體系20μL計，各個加入物的用量如下：

上游引物：250～500nM；生物素標記下游引物：250～500nM；DNA聚合酶：0.5～1U；四種dNTPs，各100～250μM；10×PCR Buffer：2.0μL；基因組DNA：1-50ng，去離子水補足體積20μL。

8.根據權利要求7所述的基于非標記探針熔解技術檢測CYP2D6基因拷貝數的方法，其特征在于：步驟4中PCR反應參數設置如下：94～95℃，1～10min，不循環；94～95℃，5～20sec；60～62℃，20～30sec，共計31～33個循環。