[發明專利]一種N-糖基化修飾提高黑曲霉木聚糖酶熱穩定性的方法

有效

• 申請號: 202110952905.9
• 申請日: 2021-08-19
• 公開（公告）號: CN113528491B
• 公開（公告）日: 2023-08-25
• 發明（設計）人: 劉松;李陽陽;陳堅;堵國成
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/42
• 分類號: C12N9/42;C12N15/56;C12N15/80;C12N1/15;C12R1/685
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 林娟

本發明公開了一種N?糖基化修飾提高黑曲霉木聚糖酶熱穩定性的方法，屬于基因工程技術領域。通過酶學性質測定，突變體酶T59N的半衰期tsubgt;1/2/subgt;supgt;50℃/supgt;提高至340min，突變體酶A55N/D57S/T59N在50℃下孵育500min，酶活沒有下降趨勢，孵育1260min，酶活只損失25.6％。突變體酶A55N/D57S/T59N的比酶活為290.5U/mg，較xynA提高了70.4％，且在pH2.0?9.0間很穩定，孵育1h仍能保持70％以上的酶活力，具有廣闊的應用前景。

技術領域

本發明涉及一種N-糖基化修飾提高黑曲霉木聚糖酶熱穩定性的方法，屬于基因工程技術領域。

背景技術

于食品、醫藥、飼料和新能源等方面。雖然木聚糖酶研究時間較長且來源廣泛，但是面對不同應用條件，常因為酶解效率低，耐受性不足等問題而限制了其使用。木聚糖酶主要分布于第5、8、10、11、30和43家族。目前研究最多的木聚糖酶來源于第10和第11家族，其中，11家族的木聚糖酶表現出較廣泛的pH耐受性和底物特異性，但是其熱穩定性較差是亟需解決的問題。

前期研究中，王靈等比較了畢赤酵母和大腸桿菌中表達的xynA，前者的熱穩定性和比酶活均高于后者，確定了N-糖基化對xynA的影響。方程等人將木聚糖酶xynHB的214位糖基化位點氨基酸N突變為A，突變體在畢赤酵母表達的重組酶在60℃半衰期由12min提高到65min。N-糖基化是真核生物中比較常見的蛋白質修飾現象，其可以通過糖鏈的作用影響蛋白質的結構或者起到保護的作用，從而提升蛋白質的催化效率和耐受性，但是正確位置的糖基化才能達到理想的效果，不是所有的糖基化位點的突變都能使木聚糖酶熱穩定性提高，本發明旨在尋找合適的糖基化位點以期獲得熱穩定性提高的木聚糖酶。

發明內容

[技術問題]

本發明要解決的技術問題是提供一種熱穩定性提高的木聚糖酶突變體。

[技術方案]

為了解決上述技術問題，本發明提供了一種熱穩定性提高的木聚糖酶突變體，所述木聚糖酶突變體的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.3所示。

本發明還提供了編碼上述木聚糖酶突變體的基因。

本發明還提供了攜帶上述基因的載體。

在一種實施方式中，所述載體以pMD19為表達載體。

本發明還提供了表達上述基因或上述載體的宿主細胞。

在一種實施方式中，所述宿主細胞包括真菌、細菌和古細菌。

在一種實施方式中，所述宿主細胞包括黑曲霉。

本發明還提供了一種重組菌，所述重組菌表達上述的木聚糖酶突變體。

在一種實施方式中，所述重組菌以pMD19為表達載體。

在一種實施方式中，所述重組菌以黑曲霉為宿主細胞。

本發明還提供了一種提高木聚糖酶熱穩定性的方法，所述方法為將氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示的木聚糖酶的第53位的甘氨酸突變為蘇氨酸，第55位的丙氨酸突變為天冬酰胺，第57位的天冬氨酸突變為絲氨酸，第59位的蘇氨酸突變為天冬酰胺，第61位的絲氨酸突變為天冬酰胺和/或第65位的蘇氨酸突變為天冬酰胺。

在一種實施方式中，所述方法為將氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示的木聚糖酶的第55位的丙氨酸突變為天冬酰胺，第57位的天冬氨酸突變為絲氨酸和/或第59位的蘇氨酸突變為天冬酰胺。

本發明還提供了一種用于降解木聚糖的組合物，所述組合物含有上述木聚糖酶突變體作為活性成分，以所述組合物的總重量為基準，所述木聚糖酶的含量為10-90重量％。