[發(fā)明專利]海洋來源具有抗菌作用的土曲霉M7及其次級代謝產(chǎn)物的分離及應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110949984.8
• 申請日: 2021-08-18
• 公開（公告）號: CN113789267B
• 公開（公告）日: 2023-07-11
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王穎;金國虔;祁江峰
• 申請（專利權(quán)）人: 中國藥科大學(xué)
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12P17/12;A61P31/04;C12R1/66
• 代理公司: 南京經(jīng)緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 唐循文

本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及海洋來源具有抗菌作用的土曲霉M7及其次級代謝產(chǎn)物的分離及應(yīng)用；該菌株的分類命名為土曲霉屬（Aspergillus?terreus）M7，保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為：CCTCC?NO:M?2021679，保藏日期是2021年6月7日。以黃豆固體培養(yǎng)基對該菌株進行發(fā)酵，經(jīng)甲醇浸提、硅膠G層析、Sephadex?LH?20凝膠柱層析、硅膠H層析、制備液相分離純化，獲得化合物terramide?A。terramide?A對鮑曼不動桿菌ATCC?19606具有明顯的抗菌活性，具有開發(fā)為抗菌劑的潛力。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種可以作為抗菌劑的Aspergillus?terreus的次級代謝產(chǎn)物提取、分離方法及用途。

背景技術(shù)

目前許多臨床使用的抗生素大多來源于微生物的次級代謝產(chǎn)物或其衍生物。但隨著對自然界微生物資源的不斷開發(fā)，以發(fā)現(xiàn)新種屬微生物來開發(fā)新抗生素的道路已經(jīng)越來越艱難。臨床抗生素的頻繁使用又直接導(dǎo)致現(xiàn)有抗生素的耐藥性不斷增加。相比于陸地環(huán)境，海洋環(huán)境具有無光照、低營養(yǎng)、高壓、高鹽、低溫的特點。由于海洋生存條件的苛刻，在其中生存的微生物，尤其是真菌，經(jīng)過長期的自然選擇已經(jīng)進化出與陸地真菌相比更為復(fù)雜代謝系統(tǒng)。因此以海洋微生物為研究材料能使活性化合物的中靶幾率大大提高。

曲霉屬因其豐富的次級代謝產(chǎn)物而被廣泛的研究。作為海洋環(huán)境中分布最廣的絲狀真菌，曲霉素真菌經(jīng)過長期的進化而產(chǎn)生對海洋極端環(huán)境的適應(yīng)。其中豐富多樣的次級代謝產(chǎn)物正是這些曲霉屬真菌能適應(yīng)環(huán)境非常重要的一個原因。這些曲霉屬真菌合成的次級代謝產(chǎn)物呈現(xiàn)出多種不同的結(jié)構(gòu)類型，在各種結(jié)構(gòu)類型中，聚酮類和生物堿類占到了主要部分，此外還有萜類、甾體、多肽、環(huán)肽、大環(huán)內(nèi)脂、蒽醌等其他類型化合物。因此在實驗室條件下，通過多種培養(yǎng)方法，能最大程度開發(fā)真菌產(chǎn)生有價值的次級代謝產(chǎn)物的能力。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的之一是提供提供一種該土曲霉發(fā)酵以及活性次級代謝產(chǎn)物分離的方法。

本發(fā)明的目的之二是提供海洋來源曲霉屬真菌M7次級代謝產(chǎn)物在抑制鮑曼不動桿菌19606的作用。

本發(fā)明為了實現(xiàn)以上兩個目的采用的技術(shù)方案如下：

一種土曲霉M7(Aspergillus?terreus)，保藏于中國典型培養(yǎng)物中心，保藏地址中國，武漢，武漢大學(xué)，保藏時間2021年6月7日，保藏編號是CCTCC?NO:M?2021679。

依據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供土曲霉次級代謝產(chǎn)物的制備方法，具體方法如下：

(1)孢子制備：

將保存在-80℃超低溫冰箱的土曲霉M7的甘油管接種在PDA平板上，置于28℃、黑暗培養(yǎng)3天。

(2)種子液制備：

在PDA平板上長出單菌落之后，用無菌接種環(huán)將孢子和菌絲刮至300ml?PDB液體培養(yǎng)基中，200rpm，28℃，培養(yǎng)4天。

(3)菌株發(fā)酵

按照1ml種子液/10g培養(yǎng)基的比例將種子液接種到固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，靜置培養(yǎng)30天。

(4)次級代謝產(chǎn)物提取

按照10L/1kg的比例用乙醇浸泡固體發(fā)酵產(chǎn)物，超聲浸提30分鐘，減壓抽濾得到浸提液。浸提三次。40℃減壓旋蒸除去液體，按浸提液比乙酸乙酯1：1的比例萃取三次，將萃取后的乙酸乙酯40℃減壓旋蒸后即可獲得發(fā)酵浸膏。

(5)分離純化

最終發(fā)酵浸膏依次經(jīng)硅膠G層析、Sephadex?LH-20凝膠柱層析、硅膠H層析、制備液相分離純化，即可獲得terramideA。