[發明專利]一種Taq DNA聚合酶與核酸內切酶嵌合體及其制備方法與應用

在審

• 申請號: 202110947350.9
• 申請日: 2021-08-18
• 公開（公告）號: CN113621585A
• 公開（公告）日: 2021-11-09
• 發明（設計）人: 胡松青;葉安徒;劉光毅;侯軼
• 申請（專利權）人: 華南理工大學
• 主分類號: C12N9/00
• 分類號: C12N9/00;C12N9/12;C12N9/22;C12N15/62;C12N15/70;C12N1/21;C12N15/10;C12Q1/686;C12R1/19
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 蘇運貞

本發明公開了一種Taq DNA聚合酶與核酸內切酶嵌合體及其制備方法與應用，屬于生物技術領域。本發明的嵌合體是野生型Taq DNA聚合酶經缺失突變和定點突變，以及在N末端融合一段高效親和雙鏈DNA結構域和瓣狀核酸內切酶1等方式改造而成。本發明的嵌合體在野生型Taq DNA聚合酶的基礎上，大幅提高了在PCR反應中的擴增效率和延伸速率，經化學修飾熱啟動后，適用于各類常規PCR、快速PCR、長片段PCR和熱啟動PCR。同時，該嵌合體具有5’?3’核酸外切酶活性，可應用于探針法qPCR中。該嵌合體對PCR抑制劑具有較強的耐受能力，適合在抗凝血或常規濾紙收集的血液中直接擴增DNA。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種Taq DNA聚合酶與核酸內切酶嵌合體及其制備方法與應用。

背景技術

實時熒光定量PCR(Real-time quantitative PCR，qPCR)技術是在傳統聚合酶鏈式反應(PCR)技術的基礎上引入熒光化學物質，以達到實時監測PCR反應過程的目的，彌補了普通PCR只能采用終點法觀察及無法定量分析模板的缺陷，成為了當今基因研究的重要工具。TaqMan探針法qPCR因其污染小、實時監測、定量線性范圍廣、特異性強、靈敏度高等特點，已經廣泛應用于生物醫學、農業科學、環境科學、食品安全等眾多領域。

快速和精準一直是當今檢測領域發展的需求及目標。傳統的TaqMan探針法qPCR技術需對樣本進行核酸提取，此過程不僅耗時長，且易造成樣本間核酸交叉污染和損失。而直擴型TaqMan探針法qPCR技術省去了核酸提取步驟，縮短檢測時間的同時不會因提取而造成核酸損失，大大提高檢測結果的準確性。使用具有抑制劑耐受性的耐熱DNA聚合酶是實現PCR直擴的關鍵。Taq DNA聚合酶作為所有耐熱DNA聚合酶種類中發現并應用最早，同時也是抑制劑耐受性研究較為成熟的一類DNA聚合酶，對其采用化學修飾實現熱啟動是一種可逆封閉DNA聚合酶活性的方法。熱啟動DNA聚合酶的使用能有效優化擴增的目標產物，同時抑制非特異性產物的生成，是目前TaqMan探針法qPCR試劑中的核心組分。盡管近年來涌現了多種具有耐受抑制劑能力的DNA聚合酶，然而這些DNA聚合酶大多數因缺少5’-3’核酸外切酶活性而不能水解TaqMan探針，因此無法應用在直擴型TaqMan探針法qPCR中。

綜上所述，亟需研究開發一種兼具抑制劑耐受能力強和高5’-3’核酸外切酶活性的熱啟動DNA聚合酶，以在直擴型TaqMan探針法qPCR檢測中進行應用。

發明內容

本發明的首要目的在于克服現有技術的缺點與不足，提供一種Taq DNA聚合酶與核酸內切酶嵌合體。

本發明的另一目的在于提供上述Taq DNA聚合酶與核酸內切酶嵌合體的制備方法。

本發明的再一目的在于提供上述Taq DNA聚合酶與核酸內切酶嵌合體的應用。

本發明的目的通過如下技術方案實現：

一種Taq DNA聚合酶與核酸內切酶嵌合體，命名為pFEN1-STaq，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述的嵌合體與氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的野生型Taq DNA聚合酶(NCBI登錄號為P19821.1)相比，具有以下特點：1～289位氨基酸缺失；626位谷氨酸(Glu)突變為精氨酸(Arg)；707位異亮氨酸(Ile)突變為蘇氨酸(Thr)；708位谷氨酸(Glu)突變為谷氨酰胺(Gln)；742位谷氨酸(Glu)突變為賴氨酸(Lys)；且N末端融合了雙鏈DNA結合蛋白，在雙鏈DNA結合蛋白的N末端再融合了氨基酸序列如SEQ ID No.5所示的瓣狀核酸內切酶1片段。

所述的雙鏈結合蛋白優選為氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的Sso7d(NCBI登錄號為WP_009990119.1)。雙鏈結合蛋白可以顯著提高DNA聚合酶對模板DNA的親和力。