[發明專利]一種經血間充質干細胞的制備方法

在審

• 申請號: 202110946416.2
• 申請日: 2021-08-18
• 公開（公告）號: CN113564109A
• 公開（公告）日: 2021-10-29
• 發明（設計）人: 趙輝;高蕭芳;崔蘭云;段書嬌;劉利
• 申請（專利權）人: 鄭州貝因生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 鄭州智多謀知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 41170
• 代理人: 克欣濤

1.一種經血間充質干細胞的制備方法，其特征在于包括以下步驟：

1)收集健康的月經期婦女的月經血樣，將血液收集到含抗生素保存液的經血采集管中；

2)在采集管中加入EDTA或肝素抗凝，再用PBS稀釋血液；

3)在離心管中加入適量的Ficoll-Plus分離液，再將稀釋后的血液平鋪到分離液液面上；

4)在室溫下，水平轉子離心轉速為1000rpm，離心20min；

5)離心后，細胞層在血漿層和分離層之間，移除最上層的血漿層，收集透明分離液層上方的細胞層；

6)收集的細胞層到潔凈的離心管中，再加入10ml的PBS洗滌細胞，離心轉速為300rpm，離心10min；

7)第二次離心后移除上清，細胞沉淀用培養液重懸，接種與細胞培養基，置于5％CO₂、95％濕度、37℃培養箱中培養；

8)當細胞長滿，去除培養液，用PBS進行洗滌，在加入0.25％的胰蛋白酶置于5％CO₂、95％濕度、37℃培養箱中培養，當細胞質回縮，細胞間隙增大后，立即加入培養液終止消化，反復吹打瓶壁形成細胞懸液，將細胞懸液吸入離心管，離心，移除上清；沉淀用完全培養液調整細胞濃度，接種于細胞培養皿中，置于5％CO₂、95％濕度、37℃培養箱中培養。

2.根據權利要求1所述的一種經血間充質干細胞的制備方法，其特征在于：所述Ficoll-Plus分離液是一種無毒、低內毒素水平的密度梯度分離液，所述Ficoll-Plus分離液的密度為1.077±0.001g/ml。

3.根據權利要求1所述的一種經血間充質干細胞的制備方法，其特征在于：加入適量的Ficoll-Plus分離液時，當稀釋后血液小于3ml時，加入3ml的Ficoll-Plus分離液；大于等于3ml時，加入等體積Ficoll-Plus分離液，且二者的總體積不能超過離心管的三分之二。

4.根據權利要求1所述的一種經血間充質干細胞的制備方法，其特征在于：所述Ficoll-Plus分離液使用時始終保持室溫18℃～25℃。

5.根據權利要求1所述的一種經血間充質干細胞的制備方法，其特征在于：收集健康的月經期婦女的月經血樣為新鮮的血液，為保持細胞活性，不能冷凍和冷藏，且血樣采血在2h以內。

6.根據權利要求1所述的一種經血間充質干細胞的制備方法，其特征在于：稀釋后的血液平鋪到分離液液面上，注意保持兩液面的界面清晰，可以使用吸管吸取血液，在小心的平鋪在分離液上。

7.根據權利要求1所述的一種經血間充質干細胞的制備方法，其特征在于：所述PBS稀釋血液或者洗滌細胞時，不能使用含Ca、Mg離子的緩沖液及培養液。

8.根據權利要求1所述的一種經血間充質干細胞的制備方法，其特征在于：所述離心管不使用塑料制品，避免細胞掛壁，影響分離效果。

9.根據權利要求1所述的一種經血間充質干細胞的制備方法，其特征在于：所述培養液為含有10％人體血清或胎牛血清的DMEM-F12培養液，且培養液無菌。

10.根據權利要求9所述的一種經血間充質干細胞的制備方法，其特征在于：所述DMEM-F12培養液含有200mM的L-谷氨酰胺、100U/ml的青霉素、100ug/ml的鏈霉素。