[發明專利]一種日本鰻鱺肝臟表達抗菌肽LEAP2基因啟動子及其應用

有效

• 申請號: 202110943773.3
• 申請日: 2021-08-17
• 公開（公告）號: CN113717973B
• 公開（公告）日: 2023-10-24
• 發明（設計）人: 馮建軍;彭欣慰;林鵬;王藝磊;陳鵬云
• 申請（專利權）人: 集美大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/70;C12N15/81;C12N15/85;C12N15/74;C12N15/75;C12N1/21;C12N1/19;A01K67/027;C12R1/19;C12R1/125
• 代理公司: 廈門市新華專利商標代理有限公司 35203
• 代理人: 朱凌

本發明涉及一種日本鰻鱺肝臟表達抗菌肽LEP2基因啟動子及其應用。本發明成功克隆了日本鰻鱺肝臟表達抗菌肽LEP2基因啟動子序列，并成功構建了日本鰻鱺肝臟表達抗菌肽LEAP2基因啟動子pGL3?LEAP2?pro熒光素酶報告質粒；實驗證明日本鰻鱺肝臟表達抗菌肽LEAP2基因啟動子可被病毒模擬物polyI:C、革蘭氏陰性菌重要表面抗原LPS以及嗜水氣單胞菌誘導激活。本發明可為研究日本鰻鱺肝臟表達抗菌肽LEAP2基因的表達調控機制、魚類抵御病原菌感染的天然免疫應答機制、特別是重要的魚類炎癥相關NF?κB和MAPK信號通路網絡調控機制的研究提供良好的實驗系統，為利用該啟動子構建表達載體高效表達外源基因或將該啟動子應用于轉基因魚構建創造條件。

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，尤其涉及日本鰻鱺肝臟表達抗菌肽LEP2基因啟動子及其應用。

背景技術

抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)是一類具有生物活性的小分子多肽，是機體先天性免疫防御系統的重要組成部分，能夠對革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌、真菌、病毒和寄生蟲等均具有較好抑制或殺傷作用，在天然免疫應答反應中發揮重要作用[Chung,C.-R.,J.-H.Jhong,Z.Wang,W.Chen,Wan,Horng and T.-Y.Lee(2020).Characterizationand Identification of Natural Antimicrobial Peptides on Different Organisms.International Journal of Molecular Sciences 21:986.]。魚類與哺乳動物等高等脊椎動物一樣，具有先天性免疫和適應性免疫系統。抗菌肽作為魚類先天性免疫系統的重要組成部分，當魚體受到損傷或病原微生物侵襲時，能夠迅速產生并在體內擴散以起到防御和殺傷作用。

魚類抗菌肽主要由Cathelicidins、肝臟表達抗菌肽-2(LiverexpressedAntimicrobial Peptide 2,LEAP-2)、Piscidins、β-defensins、Hepcidins、以及NKlysins組成[齊志濤,徐楊,鄒鈞,聶品(2020).水產動物抗菌肽研究進展.水產學報44(09):1572-1583.]。肝臟表達抗菌肽是一種小分子陽離子蛋白，主要在肝臟中表達，具有四個高度保守的半胱氨酸形成兩對二硫鍵，在殺滅細菌中起關鍵作用(Ma et al.2009)。已經在日本鰻鱺、金鯧魚(Trachinotus ovatus)虹鱒魚(Oncorhynchus mykiss)、在斑點叉尾鮰(Ictalurus punctatus)、武昌魚(Megalobrama amblycephala)、草魚(Ctenopharyngodonidella)、大黃魚(Larimichthys crocea)、鯉魚(Cyprinus carpio L.)等多種魚類中被鑒定出來。

但有關魚類肝臟表達抗菌肽啟動子的研究僅在金鯧魚中有所報道[Liu,B.,G.-D.Liu,H.-Y.Guo,K.-C.Zhu,L.Guo,N.Zhang,B.-S.Liu,S.-G.Jiang and D.-C.Zhang(2020).Characterization and functional analysis of liver-expressedantimicrobial peptide-2(LEAP-2)from golden pompano Trachinotus ovatus(Linnaeus 1758).FishShellfish Immunology 104:419-430；卵形鯧鲹兩種抗菌肽基因功能及轉錄調控研究，碩士論文，劉廣東，天津農學院2019，英文論文是碩士論文的一部分發表]，其內容僅涉及該啟動子在人類細胞293細胞中的轉錄活性研究，而有關肝臟表達抗菌肽啟動子是否在魚類細胞具有轉錄活性、是否能夠被病毒、細菌等病原微生物進行誘導表達的免疫調控的機制尚未見報道。

基因的表達調控已成為分子生物學研究領域的熱點，啟動子是基因表達調控的重要元件。鑒于魚類LEAP2在抗細菌和病毒免疫及其病害防治中的重要性，研究其基因表達調控機制將為通過調節LEAP2的表達來防治魚類細菌和病毒病提供新的思路。