[發明專利]一種利用重組巴斯德畢赤酵母生產天蠶素抗菌肽的方法

在審

• 申請號: 202110943752.1
• 申請日: 2021-08-17
• 公開（公告）號: CN113717987A
• 公開（公告）日: 2021-11-30
• 發明（設計）人: 倪斌;黃小星;周依寧;李毅
• 申請（專利權）人: 江蘇大學
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12N1/19;C07K14/435;C12R1/84
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明提供了一種利用重組巴斯德畢赤酵母生產天蠶素抗菌肽的方法，涉及基因工程技術領域。本發明的方法通過對pPIC9K載體和SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列進行雙酶切、連接，獲得天蠶素抗菌肽表達載體；通過將天蠶素抗菌肽表達載體轉化至巴斯德畢赤酵母菌并篩選陽性轉化子，得到重組巴斯德畢赤酵母；通過對重組巴斯德畢赤酵母進行發酵培養、提取，進而獲得天蠶素抗菌肽。本發明的方法能夠大量表達天蠶素抗菌肽，特別適合工業化大規模生產；此外，通過該方法生產的天蠶素抗菌肽的抗菌活性高，應用范圍廣泛。

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，尤其是涉及一種利用重組巴斯德畢赤酵母生產天蠶素抗菌肽的方法。

背景技術

天蠶素(cecropins)是第一個被發現的動物抗菌肽，1980年由Boman等從天蠶蛹中分離得到。該類多肽抗生素一般含有37-39個氨基酸殘基，不含半胱氨酸，其N端區域具有強堿性，可形成近乎完美的雙親螺旋結構，而在C端區域可形成疏水螺旋，兩者之間有甘氨酸和脯氨酸形成的鉸鏈區，多數多肽的C端被酰胺化，酰胺化對其抗菌活性具有重要作用。

鑒于抗菌肽在殺菌、抗腫瘤甚至抑制病毒復制等方面具有較大的應用潛力，目前國內外正致力于抗菌肽的基因工程等相關研究工作。公開號為CN101307316A的中國專利申請公開了一種以重組枯草桿菌表達系統表達天蠶素CAD抗菌肽的方法，通過人工合成sumo蛋白酶的表達操縱子、釀酒酵母小分子泛素樣蛋白與天蠶素AD的融合蛋白表達操縱子基因，克隆天蠶素AD母體基因枯草桿菌表達載體pNF11，轉化重組表達載體pNF11-CAD，從而使重組枯草桿菌在搖瓶中誘導表達。

黃亞東等人報道了一種采用PCR技術改造抗菌肽AD基因的方法，將其C末端改造為Asn編碼，改造后的抗菌肽Cecropin AD基因克隆到pPICZ-A載體上，構建成酵母重組分泌型表達載體，轉化巴斯德畢赤酵母Pichia pastoris受體菌GS115中，采用zerocin抗性標記篩選重組轉化子，經搖瓶發酵，濃縮發酵液進行酸性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析和抑菌活性檢測。結果表明，改造后的Cecropin AD基因在巴斯德畢赤酵母中獲得了表達。

然而，上述方法仍存在表達量低、抗菌肽抗菌活性有限等缺陷。鑒于此，特提出本發明。

發明內容

本發明的目的在于提供一種利用重組巴斯德畢赤酵母生產天蠶素抗菌肽的方法，該方法方法能夠大量表達天蠶素抗菌肽，特別適合工業化大規模生產；此外，通過該方法生產的天蠶素抗菌肽的抗菌活性高，應用范圍廣泛。

本發明提供一種天蠶素抗菌肽表達載體的構建方法，包括：對pPIC9K載體和SEQID NO：1所示的核苷酸序列進行雙酶切、連接，獲得天蠶素抗菌肽表達載體。

具體地，SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列如下：5’-agatctcacaaaaaaagtgaggatttttttatttttgtattgacaaaaatgggctcgtgtggtataataaatgtagtgaggtg gatgcgagctccagacaaaggaggaaaacatatgattcagaaacggaaacggacggtcagctttagattggtgttaatgt gcacgctgttatttgttagcctgcctatcacgaaaacgtctgct-3’(SEQ ID NO：1)。

本發明對天蠶素抗菌肽基因進行如上改造；結果表明，其能夠在巴斯德畢赤酵母中大量表達，且表達的天蠶素抗菌肽的抗菌活性高。

本發明還提供一種天蠶素抗菌肽表達載體，通過上述構建方法構建得到。

本發明還提供一種重組巴斯德畢赤酵母，含有上述天蠶素抗菌肽表達載體。具體地，該重組巴斯德畢赤酵母是通過將天蠶素抗菌肽表達載體轉化至巴斯德畢赤酵母菌并篩選陽性轉化子得到的。