[發(fā)明專利]一種分離艾美爾球蟲小配子的方法和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110943287.1
• 申請日: 2021-08-17
• 公開（公告）號: CN113528348B
• 公開（公告）日: 2022-04-22
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 曲自剛
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所
• 主分類號: C12N1/11
• 分類號: C12N1/11;C12N15/30;C12N15/62;C12N15/85;C12N15/90;C12R1/90
• 代理公司: 北京高沃律師事務(wù)所 11569
• 代理人: 蘇士瑩

1.一種分離艾美爾球蟲小配子的方法，包括以下步驟：基于艾美爾球蟲的GCS-1蛋白的編碼基因設(shè)計gRNA基因編輯敲入載體質(zhì)粒，所述GCS-1蛋白的編碼基因如SEQ ID NO.1所示，設(shè)計的引物序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示；

構(gòu)建含有兩個同源臂5'-ARM和3'-ARM的目的基因供體載體，在5'-ARM和3'-ARM之間存在編碼外源熒光蛋白和DHFR的序列片段，獲得含有5'-ARM、GCS-1、外源熒光蛋白、DHFR和3'-ARM片段的供體載體質(zhì)粒；

在構(gòu)建同源模板時，擴增如SEQ ID NO.6所示的上游EtGCS-1-5'-ARM的基因片段；構(gòu)建攜帶有EtGCS-1、外源熒光蛋白和DHFR耐藥乙胺嘧啶基因的片段EtGCS-1-外源熒光蛋白-DHFR，其中EtGCS-1的序列如SEQ ID NO.1所示，DHFR基因如SEQ ID NO.14所示；擴增如SEQID NO.26所示的上游EtGCS-1-3'-ARM的基因片段；隨后將含有同源臂的EtGCS-1-5'-ARM、EtGCS-1-3'-ARM和EtGCS-1-外源熒光蛋白-DHFR序列和經(jīng)過BamHI和HindIII酶切后的pCDNA3.1(+)載體序列依次連接，獲得成功的打靶DHFR抗性質(zhì)粒pCDNA3.1-EtGCS-1-外源熒光蛋白-DHFR；

采用CRISPR/Cas9介導(dǎo)的在特異性位點整合來插入熒光基因和抗性篩選元件；采用EtGCS-1基因上游同源臂EtGCS-5'-ARM、EtGCS的編碼閱讀框、外源熒光蛋白與DHFR的融合基因片段與下游同源臂EtGCS-3'-ARM連接來構(gòu)建重組質(zhì)粒作為打靶質(zhì)粒；通過子孢子轉(zhuǎn)染的方式將整合有g(shù)RNA基因編輯敲入載體質(zhì)粒和整合有5'-ARM、GCS-1、外援熒光蛋白、DHFR和3'-ARM片段的供體載體質(zhì)粒整合至子孢子中；

將編碼熒光蛋白的基因序列與艾美爾球蟲的特異性基因融合，敲入到艾美爾球蟲的基因組中，篩選表達融合基因的目標球蟲；所述篩選優(yōu)選包括利用上述子孢子感染雞并且在飲水或飼料中添加乙胺嘧啶進行藥物篩選，經(jīng)三次傳代，將篩選陽性的蟲體感染雞，所述陽性的表現(xiàn)為：表現(xiàn)外源熒光蛋白熒光并且存活；

收集感染艾美爾球蟲卵囊136h的雞的盲腸，取出盲腸黏膜組織，去除內(nèi)容物，隨后將其用透明質(zhì)酸酶消化，隨后經(jīng)過濾篩和薄膜過濾，取其未濾過部分；隨后經(jīng)3200rpm，離心5分鐘，取沉淀物，用PBS液離心洗滌2次；

所述沉淀物中帶有熒光的個體即為艾美爾球蟲小配子，利用流式分選的方法篩選帶有熒光的個體。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述艾美爾球蟲的種類包括柔嫩艾美爾球蟲、毒害艾美爾球蟲、巨型艾美爾球蟲、堆型艾美爾球蟲、和緩艾美爾球蟲、布氏艾美爾球蟲或早熟艾美爾球蟲。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述過濾包括依次過60目分子濾篩、260目分子濾篩和17μm耐高溫聚酯薄膜過濾，濾液再過5μm的耐高溫聚酯薄膜；

所述離心包括取耐高溫聚酯薄膜的膜上殘留物進行離心；

所述離心的轉(zhuǎn)速為3200rpm，時間為5min。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，利用外源熒光蛋白包括mCherry或EYFP。