[發(fā)明專利]一種牡丹莖葉愈傷組織誘導(dǎo)方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110941882.1
• 申請日: 2021-08-17
• 公開（公告）號(hào): CN113678732A
• 公開（公告）日: 2021-11-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 尚宏芹;高嘉敏;張鳳云;高昌勇
• 申請（專利權(quán)）人: 菏澤學(xué)院
• 主分類號(hào): A01H4/00
• 分類號(hào): A01H4/00
• 代理公司: 北京眾允專利代理有限公司 11803
• 代理人: 沈小青

1.一種牡丹莖葉愈傷組織誘導(dǎo)方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1：取材并處理：選取牡丹幼嫩的莖、葉或者由種子發(fā)芽形成的幼嫩的莖、葉，對選取的莖、葉進(jìn)行消毒并在超凈工作臺(tái)上對選取的莖、葉進(jìn)行處理；

S2：制備培養(yǎng)基：采用MS培養(yǎng)基，同時(shí)加入營養(yǎng)物質(zhì)、生長素IAA、生長素類似物、細(xì)胞分裂素和2,4-D；

S3：接種誘導(dǎo)愈傷組織：將處理后的莖、葉放入培養(yǎng)基進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)；

S4：培養(yǎng)維護(hù)：在進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)時(shí)，對培養(yǎng)基周圍環(huán)境進(jìn)行檢測，并對培養(yǎng)基內(nèi)環(huán)境進(jìn)行設(shè)置，維持培養(yǎng)的正常進(jìn)行；

S5：繼代培養(yǎng)：通過更換新鮮培養(yǎng)基進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種牡丹莖葉愈傷組織誘導(dǎo)方法，其特征在于，所述S1中，將選取的莖、葉用洗滌劑和清水洗凈，并用在70％酒精中浸泡過的紗布擦拭莖、葉表面，然后將莖、葉浸泡在濃度為0.1-0.2％氯化汞中消毒8-12min，用無菌水沖洗4-6遍，沖洗后將莖、葉置于無菌濾紙上吸去表面水分。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種牡丹莖葉愈傷組織誘導(dǎo)方法，其特征在于，所述S1中，先用紫外燈照射超凈工作臺(tái)15min，然后在超凈工作臺(tái)上將消毒的葉使用已消毒的打孔器打成4-6mm的圓片作為外植體,將已消毒的莖用灼燒并冷卻的刀片切成大小均勻的塊狀作為外植體。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種牡丹莖葉愈傷組織誘導(dǎo)方法，其特征在于，所述S2中，采用的MS培養(yǎng)基中需加入瓊脂制備MS固體培養(yǎng)基，并且加入的瓊脂質(zhì)量為總MS培養(yǎng)基質(zhì)量的0.6-1％。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種牡丹莖葉愈傷組織誘導(dǎo)方法，其特征在于，所述S2中，加入的營養(yǎng)物質(zhì)為蔗糖溶液3ml/L、酵母提取物4-6mg/L、硝酸鐵溶液5-7ml/L,加入的生長素類似物為NAA0.01-10mg/L、吲哚-3-乙酸0.01-10mg/L，加入的細(xì)胞分裂素為KT0.1-10mg/L、6-BA 0.1-10mg/L。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種牡丹莖葉愈傷組織誘導(dǎo)方法，其特征在于，所述S3中，將外植體接種到MS培養(yǎng)基進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，接種時(shí)在酒精燈火焰旁進(jìn)行接種，接種后將培養(yǎng)基放在23-27℃無菌環(huán)境中培養(yǎng)直至愈傷組織形成，培養(yǎng)期間每天進(jìn)行16h光照培養(yǎng)，8h黑暗培養(yǎng)，其中光照強(qiáng)度的范圍在1500-3000lx。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種牡丹莖葉愈傷組織誘導(dǎo)方法，其特征在于，將外植體接種到MS培養(yǎng)基進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)時(shí)采用多組同時(shí)誘導(dǎo)，同時(shí)設(shè)置空白培養(yǎng)基，進(jìn)行對比培養(yǎng)。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種牡丹莖葉愈傷組織誘導(dǎo)方法，其特征在于，所述S4中，培養(yǎng)過程中要實(shí)時(shí)對培養(yǎng)基周圍環(huán)境的濕度和溫度進(jìn)行測定，并在進(jìn)行培養(yǎng)前通過加入緩沖物質(zhì)保持培養(yǎng)基pH維持在5.8，其中用pH計(jì)對pH進(jìn)行檢測，且加入的緩沖物質(zhì)包括聚乙二醇、MES緩沖液和天然有機(jī)添加物，濕度需保持在50％-70％。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種牡丹莖葉愈傷組織誘導(dǎo)方法，其特征在于，所述S5中，通過更換新鮮培養(yǎng)基進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)，誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基要兩周更換一次，且更換過程需在無菌環(huán)境中將進(jìn)行。