[發明專利]基于鏈交換擴增的miRNA-208a擴增引物對及其檢測試劑盒

在審

• 申請號: 202110941448.3
• 申請日: 2021-08-17
• 公開（公告）號: CN113481286A
• 公開（公告）日: 2021-10-08
• 發明（設計）人: 張宇;田培龍;莊林林;王路海;馬明;顧寧;王建國
• 申請（專利權）人: 東南大學;徐州淮海生命科學產業研究院有限公司
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 王艷

本發明公開了基于鏈交換擴增的miRNA?208a擴增引物對及其檢測試劑盒，所述擴增引物對包含正向引物和反向引物，正向引物由5’端側平衡序列和3’端側擴增序列組成，擴增序列與miRNA?208a?3p的5’端側序列同源；反向引物由5’端側擴增序列和3’端側平衡序列組成，擴增序列與miRNA?208a?3p的3’端側序列互補。本發明的miRNA?208a等溫擴增反應完成后加入運行緩沖液，混勻滴加到試紙條加樣窗口，2分鐘后檢測熒光信號。本發明的檢測方法可在1小時內完成。本發明miRNA?208a檢測方法操作簡便，快速、安全，可為急性心肌梗死提供一種早期分子診斷檢測方法。

技術領域

本發明涉及基于鏈交換擴增的miRNA-208a擴增引物及其檢測試劑盒，屬于分子生物學檢測技術、側流層析技術等技術領域。

背景技術

心血管疾病的發病率和死亡率呈逐年上升趨勢，極大地威脅著人民群眾的生命與健康。我國現有心血管疾病患者人數約為3.3億，心血管疾病居城鄉居民總死亡原因之首，防治心血管疾病迫在眉睫。冠心病是心血管疾病中的一種，而急性心肌梗死(Acutemyocardial infarction，AMI)是冠心病發作時最主要的臨床表現。心肌細胞受到損傷時，會釋放蛋白類、外泌體等進入到外周血中，在不同的時間范圍內達到峰值并持續一段時間。臨床上一般認為這段時間為最佳檢測時機，相關物質的測定結果將作為檢測報告的重要依據，這些物質因此也被稱為心肌標志物。心肌標志物在臨床早期診斷、術前術中的實施方案以及預后治療等各環節具有十分重要的意義。

目前，臨床上診斷AMI常用的心肌標志物為心肌肌鈣蛋白(cTn)，血清中cTn異常升高即可診斷為心肌損傷，但cTn水平也可能在冠狀動脈疾病和非心臟疾病中上調，因此缺乏特異性，且具有時間滯后性。近年來，非編碼RNA分子中的microRNA(miRNA) 已經被證實可以調節如高血壓、瓣膜病、AMI等病理性的復雜過程。miRNA被證實在 AMI患者的血液中可以被檢測出，同時其在血液循環中具有穩定性。其中，miR-208a 在AMI患者的血漿中1小時內可顯著升高至檢測水平，而在健康人群的血漿中不存在，被認為具有作為AMI生物標志物的重要潛在價值。

當前，可用于檢測和定量分析miRNA的方法包括miRNA克隆、RNA印跡法、微陣列雜交、熒光定量PCR(RT-qPCR)等，但這些方法仍然有其局限性。克隆法具有識別新的miRNA的優勢，但并不是一種準確的miRNA定量方法。常規RNA印跡法敏感性較差，且耗時、費力，需要大量的RNA樣本和放射性探針。微陣列雜交法涉及到探針的修飾、芯片的制作及miRNA的標記等，成本較高，且設計復雜。常用的RT-qPCR 法靈敏度高、特異性強，但儀器和試劑成本均較高，且需要訓練有素的操作人員，難以在基層醫療單位和現場檢測中廣泛使用。

因此，本領域亟需開發一種能夠準確檢測miRNA-208a，檢測時間短、靈敏度高、不需要昂貴的設備和試劑且適于現場快速檢測的方法。這對于及時診斷并救治AMI患者具有極其重要的意義。

發明內容

發明目的：本發明所要解決的技術問題是提供了等溫擴增引物對。

本發明還要解決的技術問題是提供了等溫擴增引物在制備檢測miRNA-208a試劑盒中的應用。

本發明最后所要解決的技術問題是針對現有技術在檢測miRNA-208a中的局限性，提供一種快速檢測miRNA-208a的熒光定量試劑盒及檢測方法，具有操作簡便、靈敏度高、特異性強、重復性好、適用性廣、可數字化判讀的特點。