[發(fā)明專利]一種大腸桿菌助溶表達質(zhì)粒及其構(gòu)建方法與應用

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• 申請日: 2021-08-16
• 公開（公告）號: CN113621637A
• 公開（公告）日: 2021-11-09
• 發(fā)明（設計）人: 潘麗霞;周會敏;楊登峰;陽麗艷;李紅亮
• 申請（專利權(quán)）人: 廣西科學院
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/64;C12N15/31;C12N15/54;C12N9/10
• 代理公司: 北京睿智保誠專利代理事務所(普通合伙) 11732
• 代理人: 王燦

本發(fā)明涉及生物工程技術領域，尤其涉及一種大腸桿菌助溶表達質(zhì)粒及其構(gòu)建方法與應用。本發(fā)明助溶表達質(zhì)粒的構(gòu)建方法，包括如下步驟：(1)以鏈霉菌DNA為模板，擴增得到伴侶基因groEL1、groES1和groEL2；(2)將伴侶基因groEL1、groES1和groEL2克隆至刪除groEL和groES基因片段的大腸桿菌質(zhì)粒載體pGro7上，得到助溶表達質(zhì)粒pGroE。將本發(fā)明的pGroE質(zhì)粒與dnmS和/或dnmQ基因編碼的糖基化轉(zhuǎn)移酶共表達，較pGro7質(zhì)粒能顯著提高其可溶性，該助溶表達質(zhì)粒的開發(fā)，為解決基因表達時的包涵體問題提供了良好的解決方案。

技術領域

本發(fā)明涉及生物工程技術領域，尤其涉及一種大腸桿菌助溶表達質(zhì)粒及其構(gòu)建方法與應用。

背景技術

DNA重組技術使得體外表達目的蛋白成為可能。大腸桿菌以其易于遺傳操作、繁殖速度快、表達重組蛋白產(chǎn)量高、培養(yǎng)成本低等特點，優(yōu)于其他蛋白質(zhì)異源表達宿主，成為分子生物學研究的有力工具。然而，大腸桿菌無法實現(xiàn)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄后的修飾，胞質(zhì)內(nèi)還原性環(huán)境不利于二硫鍵的形成和穩(wěn)定，造成部分重組蛋白無法正確折疊，進而，容易形成無生物活性不可溶的包涵體。

解決包涵體問題的方法有降低表達溫度，更換弱啟動子或RBS序列，采用分子伴侶協(xié)助表達以及提高二硫鍵折疊效率?，F(xiàn)有技術的這些方法在提高外源蛋白表達方面仍然有待進一步提高。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種可以有效提高外源蛋白表達量的大腸桿菌助溶表達質(zhì)粒及其構(gòu)建方法與應用。

為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術方案：

本發(fā)明提供了一種大腸桿菌助溶表達質(zhì)粒的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

(1)以鏈霉菌DNA為模板，擴增得到伴侶基因groEL1、groES1和groEL2；

(2)將伴侶基因groEL1、groES1和groEL2克隆至刪除groEL和groES基因片段的大腸桿菌質(zhì)粒載體pGro7上，得到助溶表達質(zhì)粒pGroE。

作為優(yōu)選，伴侶基因groEL1的序列如SEQ ID NO.1所示；

伴侶基因groES1的序列如SEQ ID NO.2所示；

伴侶基因groEL2的序列如SEQ ID NO.3所示。

作為優(yōu)選，擴增時的反應體系為：鏈霉菌DNA 1μL，上下游引物各1μL，2×PhantaMax MasterMix 25μL，ddH₂O 22μL；

擴增的條件為：95℃預變性5min；95℃30s，55℃～60℃30s，72℃2min～3min，共35個循環(huán)；72℃，10min。

作為優(yōu)選，擴增伴侶基因groEL1的引物如SEQ ID NO.4～5所示；

擴增伴侶基因groES1的引物如SEQ ID NO.6～7所示；

擴增伴侶基因groEL2的引物如SEQ ID NO.8～9所示。

作為優(yōu)選，克隆時的反應體系為：刪除groEL和groES基因片段的大腸桿菌質(zhì)粒載體pGro71μL，伴侶基因groEL1、groES1和groEL2各1μL，2×ClonExpress Mix 5μL，ddH₂O 1μL；

克隆時的反應條件為：48～52℃反應4～6min。

本發(fā)明還提供了所述的方法制備得到的助溶表達質(zhì)粒pGroE。

本發(fā)明還提供了所述的質(zhì)粒pGroE在促進糖基轉(zhuǎn)移酶可溶表達中的應用。