[發(fā)明專利]多肽標(biāo)簽、高度可溶性的重組腈水解酶及其在醫(yī)藥化學(xué)品合成中的應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110936187.6
• 申請(qǐng)日: 2020-11-03
• 公開（公告）號(hào): CN113801239B
• 公開（公告）日: 2023-10-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 薛亞平;謝冬;熊能;鄭裕國(guó)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江工業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C07K19/00
• 分類號(hào): C07K19/00;C12N9/78;C12N1/21;C12P13/00;C12P7/42;C12R1/19
• 代理公司: 杭州天正專利事務(wù)所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;李世玉

本發(fā)明公開了一種多肽標(biāo)簽、高度可溶性的重組腈水解酶及其在醫(yī)藥化學(xué)品合成中的應(yīng)用，所述重組酶是將多肽標(biāo)簽連接至腈水解酶氨基酸序列的N端所得到的酶；所述多肽標(biāo)簽的氨基酸序列為GKGKGKG。本發(fā)明重組腈水解酶制備1?氰基環(huán)己基乙酸時(shí)活力高達(dá)3034.7U/g dcw，多肽標(biāo)簽的引入顯著提高了腈水解酶的可溶性表達(dá)，相同濃度全細(xì)胞催化劑水解1M底物時(shí)較母本酶快30min完成，且穩(wěn)定性優(yōu)于母本酶。本發(fā)明重組腈水解酶還能夠催化合成其它醫(yī)藥中間體，并提高反應(yīng)中全細(xì)胞催化劑的活力，提高其它不同種類腈水解酶的可溶性，以及相應(yīng)的全細(xì)胞催化劑的活力。

本申請(qǐng)為“申請(qǐng)?zhí)?020112112516，申請(qǐng)日2020年11月3日，名稱為多肽標(biāo)簽、高度可溶性的重組腈水解酶及其在醫(yī)藥化學(xué)品合成中的應(yīng)用”專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)

(一)技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種多肽標(biāo)簽，特別涉及一種可增強(qiáng)腈水解酶等酶可溶性表達(dá)的通用多肽標(biāo)簽，及在醫(yī)藥化學(xué)品合成中的應(yīng)用，屬于基因工程以及蛋白質(zhì)工程技術(shù)領(lǐng)域。

(二)背景技術(shù)

腈水解酶(EC 3.5.5.1)是一類重要的具有Glu-Lys-Cys催化活性中心三聯(lián)體的水解酶，可在一步反應(yīng)中有選擇地且有效地催化氰基水解為羧基，在有機(jī)酸、氨基酸、維生素等化工產(chǎn)品和如加巴噴丁、氯吡格雷、巴氯芬、阿托伐他汀等醫(yī)藥化學(xué)品的合成中具有廣泛的應(yīng)用。

迄今為止，已經(jīng)報(bào)道了許多提高蛋白質(zhì)可溶性表達(dá)水平的有效方法，一種是構(gòu)建重組周質(zhì)滲漏菌株或共表達(dá)周質(zhì)伴侶蛋白，另一種是添加融合標(biāo)簽(也稱為融合伴侶或溶解性標(biāo)簽)進(jìn)行協(xié)同表達(dá)。但這些方法或多或少的存在一些缺陷。如多肽標(biāo)簽上氨基酸的選擇、序列的長(zhǎng)度可能對(duì)重組酶的酶活，穩(wěn)定性，溶解度或選擇性有很大副作用，某些標(biāo)簽甚至?xí)淖兠傅鞍椎慕Y(jié)構(gòu)導(dǎo)致酶完全失去活性。對(duì)于不同的酶的結(jié)構(gòu)和蛋白整體在催化體系中的帶電屬性，不同的多肽標(biāo)簽的引入會(huì)帶來(lái)不同的效果，需要結(jié)合動(dòng)力學(xué)模擬、同源建模等技術(shù)進(jìn)行協(xié)助標(biāo)簽的設(shè)計(jì)。但是有效的多肽標(biāo)簽的優(yōu)點(diǎn)之一是和目的基因連接后表達(dá)并不需要去除即可發(fā)揮酶蛋白的作用。其中，Sun-Ki Kim開發(fā)了一種新的聚陰離子多肽標(biāo)簽，顯著提高了南極假絲酵母脂肪酶的表達(dá)水平和細(xì)胞外轉(zhuǎn)運(yùn)效率。此外，Han等人開發(fā)了一種新的融合標(biāo)簽[HE-MBP(Pyr)]以提高重組蛋白在大腸桿菌中的溶解度，研究表明目的蛋白(如單克隆抗體，抗原蛋白和聚合蛋白)溶解度有不同程度的改善。

在生物合成方法中，涉及到生物催化的過(guò)程通常都是使用全細(xì)胞催化劑(濕細(xì)胞)來(lái)進(jìn)行的。一般認(rèn)為產(chǎn)酶發(fā)酵中發(fā)酵液的體積酶活為比酶活和可溶性表達(dá)水平兩者的結(jié)合。若能在不影響原始特性的前提下，提高酶的比酶活或有效蛋白質(zhì)的數(shù)量將促進(jìn)全細(xì)胞催化性能的進(jìn)一步提高。所以，增加腈水解酶在大腸桿菌中的溶解度是有巨大意義的。然而增加大腸桿菌所產(chǎn)酶的溶解度是總是以犧牲活力為代價(jià)的。因此，在不降低催化水平的情況下合理地增加腈水解酶的溶解度是實(shí)現(xiàn)加巴噴丁中間體1-氰基環(huán)己基乙酸(1-CA)的高效生產(chǎn)仍需進(jìn)一步研究。

(三)發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的是提供一種多肽標(biāo)簽、含多肽標(biāo)簽的重組酶及其在醫(yī)藥化學(xué)品合成中的應(yīng)用，所述多肽標(biāo)簽?zāi)軌蚴购嚯臉?biāo)簽的重組酶的全細(xì)胞催化劑活力和熱穩(wěn)定性均得到有效提升。解決酶熱穩(wěn)定性差，酶活不滿足工業(yè)大規(guī)模應(yīng)用等問(wèn)題。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

本發(fā)明提供一種多肽標(biāo)簽，所述多肽標(biāo)簽兩端的氨基酸均為不帶電的甘氨酸(G)，其余為甘氨酸(G)、組氨酸(H)、谷氨酸(E)、天冬氨酸(D)、賴氨酸(K)、精氨酸(R)中任意一種或多種的隨機(jī)組合；所述多肽標(biāo)簽的長(zhǎng)度為5－11個(gè)氨基酸。