[發明專利]用于自誘導蛋白表達的方法和系統

在審

• 申請號: 202110934293.0
• 申請日: 2014-12-19
• 公開（公告）號: CN113621635A
• 公開（公告）日: 2021-11-09
• 發明（設計）人: 杜方勇;羅培志
• 申請（專利權）人: 天演藥業有限公司
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63
• 代理公司: 中科專利商標代理有限責任公司 11021
• 代理人: 吳小明

本文中提供在不需要添加外源誘導物的情況下自誘導基因表達的方法和系統。在一個方面，提供一種雙遺傳元件系統，其包括第一高拷貝數遺傳元件，所述第一高拷貝數遺傳元件包含在誘導型啟動子控制下的第一目的基因；和第二低拷貝數遺傳元件，所述第二低拷貝數遺傳元件包含編碼轉錄因子的基因，所述編碼轉錄因子的基因在表達后調節自所述誘導型啟動子的轉錄；其中自所述誘導型啟動子的轉錄的激活不需要添加外源誘導物。

本申請是申請日為2014年12月19日、發明名稱為“用于自誘導蛋白表達的方法和系統”的中國專利申請NO.201480084652.6的分案申請。

技術領域

本公開內容總體上涉及用于體外基因表達的方法和系統，特別是遺傳元件如帶有調節元件的質粒。

背景技術

在抗體篩選過程如噬菌體展示期間，通常要篩選數百或甚至數千的命中以鑒定結合給定靶標的多個表位的各種抗體片段。對于這些命中中的每種都需要制備足夠量的表達和純化的抗體片段以用于進一步表征。典型地，編碼相應抗體片段的基因被一同亞克隆到不同的表達載體中，或帶有目的基因的噬菌體展示載體被轉化成表達載體。然后，表達載體被轉化到宿主細胞(典型地，大腸桿菌)中，并且轉化體被接種到小量的培養物(1-3ml)中過夜培養。當培養物生長至對數期時，加入終濃度為0.1-1mM的誘導物(最常見的是用于lac啟動子的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG))以誘導抗體片段的表達。

當同時處理數百或甚至數千種細胞培養物時，非常困難的是保證在誘導前所有的培養物都處于基本相似的生長狀態。時滯或生長速率的差異通常導致這樣的情形，其中不同的培養物處于不同的生長期中并且適于誘導的時間不同。通常需要相當的努力以通過在不同時間點測量600nm處的光密度(OD)(OD600)來跟蹤不同培養物的生長，然后單獨地在合適的時間向各培養物中添加IPTG。

因此，在將克隆接種到液體培養物中后不需要監視多個培養物的生長期且不需要添加誘導物的自誘導表達系統具有優勢。第一個自誘導系統由F.William Studier(Studier(2005)Protein Expr Purif 41(1):207-234)開發。該系統是基于流行的pET細菌表達系統，其中靶蛋白由被T7 RNA聚合酶非常特異地識別的強效T7啟動子控制。T7 RNA聚合酶又被置于已被很好表征的誘導型lac啟動子的控制下。普遍接受的是，常用于細菌蛋白表達的野生型lac啟動子太弱而無法直接表達靶蛋白(Rosano等(2014)Frontiers inMicrobiology 5(172)1-17；Deuschle等(1986)EMBO J 5(11):2987-2994；Makoff等(1991)Nucleic Acids Res 19(9):2417-2421)，并且因此其更常與其他誘導型系統如T7表達系統一起使用。然而，本領域中已知，T7啟動子介導的蛋白表達在細菌細胞內可能過強。因此，T7啟動子通常不優選用于在大腸桿菌中表達膜蛋白或分泌蛋白((Wagner等(2008)Proc NatlAcad Sci USA 105(38):14371-14376)，因為在胞質中過快地產生過多的蛋白，并且其壓倒細菌分泌系統的有限能力，這導致蛋白的積累和聚集、對宿主細胞的毒性并且最終導致宿主細胞死亡。

一種針對膜蛋白生產設計的改進的pET系統采用受調節的T7溶菌酶(一種T7 RNA聚合酶的抑制劑)的表達以下調T7 RNA聚合酶的活性從而減緩蛋白生產速率(Wagner等(2008)Proc Natl Acad Sci USA 105(38):14371-14376)。然而，該系統需要小心地滴定誘導物L-鼠李糖的濃度。此外，以上現有的自誘導系統與噬菌體展示系統不相容并且需要將目的基因由展示載體亞克隆到新的表達載體，這是耗時耗錢的。

Genentech也開發了一種細菌表達系統，其是基于PhoA啟動子(Simmons等,Journal of Immunological Methods 263(2002)133–147)。當培養基中的磷酸鹽濃度被耗盡時，靶蛋白被誘導。然而，該系統要求大腸桿菌轉化體在專門的C.R.A.P.磷酸鹽限制性培養基中生長，這種培養基的制備費用相當昂貴。