[發明專利]一種蛋白純化方法及其應用

在審

• 申請號: 202110930293.3
• 申請日: 2021-08-13
• 公開（公告）號: CN113735941A
• 公開（公告）日: 2021-12-03
• 發明（設計）人: 喻曉蔚;徐巖;徐曉宇
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C07K14/00
• 分類號: C07K14/00;C12N15/11;C07K19/00;C07K1/14;C12N9/20;C12N15/70
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 趙巧娜

1.一種斷裂內含肽，其特征在于，包含N端內含肽IN和C端內含肽IC，所述N端內含肽IN的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述C端內含IC的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.如權利要求1所述的斷裂內含肽，其特征在于，編碼所述N端內含肽IN的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；編碼所述C端內含肽IC的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

3.一種親和配基，其特征在于，將氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的N端內含肽IN與ELP蛋白進行融合，制備得到在ELP的N端融合N端內含肽的親和配基IN-ELP；所述ELP蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

4.一種蛋白純化工具，其特征在于，所述純化工具包括親和配基、親和標簽；所述親和配基為：將氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的N端內含肽IN與ELP蛋白進行融合，制備得到在ELP的N端融合N端內含肽的親和配基IN-ELP；所述ELP蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；

所述親和標簽為：將氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的C端內含肽作為親和標簽，將目的蛋白的N端與親和標簽連接。

5.一種蛋白純化方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

(1)將N端內含肽與ELP蛋白進行融合，制備得到在ELP的N端融合N端內含肽的親和配基IN-ELP；將C端內含肽作為親和標簽，與目的蛋白融合，制備得到N端融合了C端內含肽的IC-目的蛋白；

(2)將IC-目的蛋白，與親和配基IN-ELP混合，使IN-ELP結合IC-目的蛋白，得到混合液；向混合液中添加氯化鈉溶液進行孵育后離心取沉淀，將沉淀用pH 8.0～10.0的結合緩沖液重懸后離心取上清液；將上清液與氯化鈉溶液進行孵育后離心，收集沉淀；

(3)將步驟(2)得到的沉淀采用切割緩沖液重懸，在25-37℃，pH 6.0～7.0條件下進行反應后，添加氯化鈉溶液進行孵育，孵育結束后離心，得到的含有純化后目的蛋白的上清液；所述切割緩沖液為磷酸緩沖液。

6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述ELP蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

7.如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述目的蛋白為：增強型綠色熒光蛋白或脂肪酶。

8.如權利要求7所述的方法，其特征在于，親和配基IN-ELP的制備方法為：

(1)分別在N端內含肽IN、ELP蛋白添加酶切位點后，插入到載體pET28a中，制備得到在ELP的N端融合IN的重組質粒；

(2)將重組質粒轉入宿主細胞中，得到表達融合蛋白的重組菌株，將重組菌株發酵制備得到親和配基IN-ELP。

9.如權利要求8所述的方法，其特征在于，所述IC-目的蛋白的制備方法為：

(1)化學合成目的蛋白片段；

(2)分別使用引物將IC序列與目的蛋白片段插入到載體pET28a中，制備得到含有N端融合了C端內含肽的目的蛋白的重組質粒；

(3)將重組質粒轉入宿主細胞中，得到表達N端融合了IC的目的蛋白的重組菌株，將重組菌株發酵制備得到N端融合了IC的目的蛋白。

10.權利要求1或2所述的斷裂內含肽，或權利要求3所述的親和配基，或權利要求4所述的蛋白純化工具，或權利要求5～9任一所述的方法在目的蛋白純化中的應用。