[發(fā)明專利]編碼弓形蟲SAG抗原的核酸及其應(yīng)用、該抗原的制備方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110930001.6
• 申請(qǐng)日: 2021-08-13
• 公開（公告）號(hào): CN116179569A
• 公開（公告）日: 2023-05-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉梁濤;張文婧;趙巧輝;鄧娟;李桂林;付光宇;吳學(xué)煒
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 鄭州伊美諾生物技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/30
• 分類號(hào): C12N15/30;C12N15/81;C12N1/19;C12P21/02;C07K1/34;C07K1/18;C07K1/22;C07K1/36;G01N33/569;C12R1/84
• 代理公司: 北京集佳知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11227
• 代理人: 王歡

本發(fā)明涉及免疫學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及編碼弓形蟲SAG抗原的核酸及其應(yīng)用、該抗原的制備方法。本本發(fā)明對(duì)SAG抗原的編碼序列進(jìn)行了優(yōu)化，獲得了一種高效表達(dá)SAG抗原的核苷酸序列(SEQIDNO:1)，并構(gòu)建了含該SAG抗原的重組載體。與SAG未優(yōu)化的編碼序列相比，優(yōu)化后的序列表達(dá)量顯著提高，對(duì)IgM抗體表現(xiàn)出更高的靈敏度。本發(fā)明通過控制發(fā)酵過程DO及罐壓，以及對(duì)起始誘導(dǎo)菌體量并采用甲醇?山梨醇共補(bǔ)碳源的策略，對(duì)獲得的上清通過改進(jìn)分離純化工藝，可獲得高純度＞95％的SAG抗原。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及免疫學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及編碼弓形蟲SAG抗原的核酸及其應(yīng)用、該抗原的制備方法。

背景技術(shù)

弓形蟲是一種屬孢子綱真球蟲目的專性細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲，可以寄生在溫血?jiǎng)游锏募?xì)胞內(nèi)，可以感染人體引起弓形蟲病。弓形蟲病流行于世界各地，幾乎所有的哺乳動(dòng)物都有弓形蟲寄生。目前已知的弓形蟲基因重組抗原主要包括膜表面抗原、棒狀體蛋白、微線體蛋白、基質(zhì)抗原等。目前已知的弓形蟲抗體檢測(cè)方法包括ELISA、Western-blot等血清學(xué)檢測(cè)，檢測(cè)抗體的包被抗原仍主要來源于鼠/組織培養(yǎng)的T.gondii速殖子制備的蟲體抽提抗原，含有大量非特異性抗原物質(zhì)，且制備程序煩瑣，不易標(biāo)準(zhǔn)化，因此，需通過基因工程技術(shù)制備高度純化的診斷抗原有著十分廣闊的應(yīng)用前景。

弓形蟲速殖子表膜是宿主免疫系統(tǒng)識(shí)別并殺傷蟲體的主要部位，SAG是弓形蟲速殖子表膜的重要抗原之一，具有較強(qiáng)的免疫原性。由于弓形蟲感染絕大多數(shù)都是由母嬰傳播，所以對(duì)孕婦做產(chǎn)前IgG和IgM檢查就顯得尤為重要，一般感染弓形蟲后，宿主體內(nèi)抗體IgM和IgG水平會(huì)顯著增高。而胎兒時(shí)期檢測(cè)是為了阻止弓形蟲對(duì)其他器官進(jìn)一步的影響，弓形蟲一旦侵染眼部，會(huì)造成視網(wǎng)膜和視神經(jīng)不可逆的破壞，最終導(dǎo)致失明。可見，對(duì)于弓形蟲病的產(chǎn)前診斷對(duì)優(yōu)生優(yōu)育具有重要的意義。

利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法(ELISA)定性檢測(cè)人血清或血漿中的IgG和IgM是弓形蟲病診斷的主要方法，目前，對(duì)于血清特異性抗體進(jìn)行檢測(cè)時(shí)常用的是蟲源性粗抗原，因其成分復(fù)雜，導(dǎo)致特異性較差，并容易產(chǎn)生交叉反應(yīng)，最終影響診斷效果。對(duì)弓形蟲表面抗原SAG進(jìn)行構(gòu)建，利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)目的蛋白，并對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，可以獲得純度不低于95％且免疫學(xué)活性正常的SAG抗原，為進(jìn)一步優(yōu)化弓形蟲血清學(xué)診斷方法和研制弓形蟲病疫苗奠定基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明提供了編碼弓形蟲SAG抗原的核酸及其應(yīng)用、該抗原的制備方法。該核酸經(jīng)過密碼子優(yōu)化，使弓形蟲SAG抗原的表達(dá)效率得到提明顯提高。利用本發(fā)明提供的制備方法制得的SAG抗原純度不低于95％。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供一種編碼弓形蟲SAG重組抗原的核酸，其為I～I(xiàn)II中任意一種：

I、如SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列的核酸；或

II、SEQ?ID?NO:1所示的核苷酸序列經(jīng)修飾、取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)核苷酸獲得的核酸；或

III、與SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列具有至少85％同源性且編碼如SEQ?ID?NO:2所示氨基酸序列的核酸。

本發(fā)明還提供了包含權(quán)利要求1所述核酸的重組載體。

一些實(shí)施方案中，所述重組載體的骨架載體為pPIC9K。

本發(fā)明還提供了轉(zhuǎn)化有所述重組載體的宿主菌。

一些實(shí)施方案中，所述宿主菌為畢赤酵母菌株。

本發(fā)明還提供了所述的核酸、所述的重組載體、所述的宿主菌在制備SAG重組抗原中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了SAG重組抗原的制備方法，將轉(zhuǎn)化有本發(fā)明宿主菌制成種子液，發(fā)酵培養(yǎng)，誘導(dǎo)SAG重組抗原的表達(dá)。