[發(fā)明專利]一種無血清培養(yǎng)凍存臍血NK細(xì)胞的方法及其試劑盒

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110927919.5
• 申請(qǐng)日: 2021-08-12
• 公開（公告）號(hào): CN113430168A
• 公開（公告）日: 2021-09-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 呂玲;邢義高;秦顯喜;李樹建;張春梅;張文俐;張秀濤;雒猛
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東省齊魯干細(xì)胞工程有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/0783
• 分類號(hào): C12N5/0783;C12N5/078
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明屬于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種無血清培養(yǎng)凍存臍血NK細(xì)胞的方法，具體包括凍存臍血單個(gè)核的高質(zhì)量提取和NK細(xì)胞的體外無血清擴(kuò)增。還涉及一種凍存臍血單個(gè)核分離試劑盒，包括含有人血白蛋白、肝素鈉和生理鹽水的臍血洗滌液，含有羥乙基淀粉和生理鹽水的臍血重懸液，含有聚蔗糖的淋巴細(xì)胞分離液。本發(fā)明可以解決凍存年限較久臍血在提取單個(gè)核過程中會(huì)產(chǎn)生絮狀沉淀、紅細(xì)胞大量殘留、細(xì)胞分層不明顯等問題以及凍存臍血NK培養(yǎng)中需要引入動(dòng)物源血清的問題。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種無血清培養(yǎng)凍存臍血NK細(xì)胞的方法及其試劑盒。

背景技術(shù)

自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell，NK細(xì)胞)，是除T細(xì)胞、B細(xì)胞之外的第三大類淋巴細(xì)胞，不僅與抗腫瘤、抗病毒感染和免疫調(diào)解有關(guān)，甚至參與超敏反應(yīng)和自身免疫性疾病的發(fā)生。NK細(xì)胞大多數(shù)具有細(xì)胞毒性。它們可產(chǎn)生大量分子(穿孔素、顆粒酶、人體顆粒溶素)的溶解顆粒，這些分子可誘導(dǎo)應(yīng)激細(xì)胞的細(xì)胞死亡。NK細(xì)胞亦表達(dá)多種腫瘤壞死因子(TNF)超家族成員，如FASL和TRAIL，分別與相應(yīng)的受體FAS或TRAILR結(jié)合誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡。此外，NK細(xì)胞產(chǎn)生一系列細(xì)胞因子(IFN-γ、TNFα、IL-10)、生長因子(GM-CSF)和趨化因子(CCL3、CCL4、CCL5、XCL1)。NK細(xì)胞可以通過與樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞相互作用來形成免疫反應(yīng)。因此，NK細(xì)胞在免疫療法中發(fā)揮著重要作用。

NK細(xì)胞無HLA限制性，有研究表明，HLA半相合細(xì)胞具有更強(qiáng)的殺瘤作用。所以，異體NK細(xì)胞的培養(yǎng)具有極高的臨床價(jià)值。相比較于外周血，臍帶血取材方便，傷害性小，污染概率低，是最佳的NK細(xì)胞制備材料。但臍帶血應(yīng)用范圍較廣，儲(chǔ)存初期應(yīng)用方向不太確定，所以會(huì)先進(jìn)行凍存處理；根據(jù)目前情況來看，凍存臍血復(fù)蘇后提取單個(gè)核細(xì)胞存在諸多問題，特別是凍存年限較久后，單個(gè)核提取尤為困難；并且因凍存臍血缺少自體血漿，凍存臍血NK細(xì)胞的培養(yǎng)往往使用胎牛血清或小牛血清，這就為NK細(xì)胞的臨床應(yīng)用埋下隱患。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的就在于解決凍存臍血提取單個(gè)核過程中出現(xiàn)的問題以及優(yōu)選出合適的血清替代物替代凍存臍血NK培養(yǎng)中引入的動(dòng)物源血清。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。

一種無血清培養(yǎng)凍存臍血NK細(xì)胞的方法，包括以下操作步驟：

(1)采用凍存臍血單個(gè)核分離試劑盒從凍存臍帶血中提取單個(gè)核細(xì)胞；

(2)將單個(gè)核細(xì)胞用NK細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為2×10⁶-4×10⁶/mL后接種于T175細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，得到細(xì)胞懸液；

(3)將上述細(xì)胞懸液體積調(diào)整至15-30mL，并加入體積分?jǐn)?shù)為10-15％的血清替代物、白細(xì)胞介素-2及滋養(yǎng)層細(xì)胞，所述血清替代物包括生長因子、粘附因子、荷爾蒙、結(jié)合蛋白、維生素、微量礦物元素；

(4)第三天進(jìn)行換液；

(5)第四天至第七天天進(jìn)行補(bǔ)液，調(diào)整細(xì)胞濃度為0.8-1.3×10⁶/mL，并加入體積分?jǐn)?shù)為10-15％的血清替代物、白細(xì)胞介素-2；

(6)第八天進(jìn)行補(bǔ)液，調(diào)整細(xì)胞濃度為0.8-1.3×10⁶/mL，并加入體積分?jǐn)?shù)為5-10％的血清替代物、白細(xì)胞介素-2及滋養(yǎng)層細(xì)胞；

(7)第九天至第十三天進(jìn)行補(bǔ)液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1-1.5×10⁶/mL，并加入體積分?jǐn)?shù)為1-5％的血清替代物、白細(xì)胞介素-2；

(8)第十四天至第十八天收取細(xì)胞，進(jìn)行計(jì)數(shù)，檢測。

具體地，采用凍存臍血單個(gè)核分離試劑盒從凍存臍帶血中提取單個(gè)核細(xì)胞的具體操作步驟為：

(1)將臍血從液氮中取出后置于37度水浴，解凍臍血；