[發明專利]一種對化學修飾的DNA進行原位表征的方法

有效

• 申請號: 202110927558.4
• 申請日: 2021-08-11
• 公開（公告）號: CN113736854B
• 公開（公告）日: 2023-09-08
• 發明（設計）人: 李峰;王冠;唐婭楠
• 申請（專利權）人: 四川大學
• 主分類號: C12Q1/6818
• 分類號: C12Q1/6818
• 代理公司: 北京領科知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11690
• 代理人: 王立紅;張丹

本發明公開了一種對化學修飾的DNA進行原位表征的方法。化學修飾是擴展天然DNA化學多樣性和功能的有效途徑。然而，當化學修飾的寡核苷酸用于基于DNA的反應或結構中時，預測和控制它們的動力學和熱力學變得相當困難。為了應對這一挑戰，本發明的方法中引入了DNA天平和砝碼探針，其能夠測量化學修飾的DNA在其天然環境中的臨界熱力學和動力學特性，例如吉布斯自由能和雜交速率常數的變化。該方法不僅可以測量穩定的化學修飾，還解決了涉及不穩定化學修飾和瞬態異構化反應的更具挑戰性的問題。該方法在生物學、生物醫學、材料科學、納米光子學和納米電子學等領域具有非常好的潛在應用價值。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種對化學修飾的DNA進行原位表征的方法及其應用。

背景技術

除了存儲和傳輸遺傳信息的生物學作用之外，DNA也已經出現在高度可編程的工程材料中，用于構建各種納米結構和納米器件。DNA納米技術的研究領域在控制分子自組裝的能力方面具有革命性，因此不僅對材料科學，而且對分子計算、生物傳感、診斷和治療學產生了顯著影響。將DNA與任何其他工程材料區分的最大優勢之一是基于獨特的Watson-Crick堿基配對規則的可預測性。重要的熱力學參數，諸如標準吉布斯自由能(ΔG°)，可以使用NUPACK等計算機工具準確預測。這種計算機工具在設計核酸雜交探針和用于各種應用的構建模塊方面發揮了關鍵作用。熱力學參數的更高級用途進一步支持了用于鑒別單核苷酸變體的超特異性雜交探針和引物的模擬指導開發。關鍵動力學參數，例如速率常數，也為toehold介導的鏈置換反應建立了良好的基礎，這是一類動態DNA納米技術的重要組成部分，使得能夠使用計算機工具諸如Visual?DSD模擬復雜的DNA反應網絡。

為了進一步擴展DNA的化學多樣性和功能性，引入了大量化學修飾，以能夠增加核酸酶抗性，調節基因表達，或允許雜交事件的空間/時間控制。在使DNA的化學性質顯著多樣化的同時，由于化學修飾所產生的變化，雜交動力學和熱力學的準確預測變得困難。可使用等溫滴定量熱法(ITC)、差示掃描量熱法(DSC)或DNA熔融分析來測量臨界熱力學參數如ΔG°和Tm。然而，這些方法通常需要繁瑣的操作和加熱程序，因此難以在其天然環境中測量化學修飾的DNA。現有的工具也局限于不穩定的DNA修飾，例如許多光轉換分子，包括偶氮苯、螺吡喃、二芳基乙烯和半硫靛等。此外，現有技術沒有提供動力學分析，因為僅記錄了靜態平衡狀態。因此，非常需要一種簡單、通用和快速的方法來測量其天然形式的化學修飾DNA的熱力學和動力學特性。

發明內容

為克服現有技術的不足，本發明提供一種對DNA的化學修飾進行檢測的方法，其包括如下步驟：

(1)根據目標DNA鏈T，制備鏈C和砝碼W；

(2)使鏈T與C雜交，得鏈CT；

(3)使鏈CT與砝碼W反應，檢測；

其中，鏈T為單鏈DNA，將其分為片段S₁和S₂(即鏈T為S₁-S₂)，其中片段S₂中包含至少一處化學修飾；

鏈C為單鏈DNA，其由片段S_r、S_m、S_f依次連接組成(即鏈C為S_r-S_m-S_f)，其中S_r和S_m分別為S₁和S₂的互補序列(即片段S_r-S_m為S₁-S₂的互補序列)，S_f為toehold序列；

鏈C和鏈T分別標記有熒光報告基團和熒光淬滅基團；