[發明專利]一種高效合成軟骨素寡聚糖的重組谷氨酸棒桿菌

有效

• 申請號: 202110926226.4
• 申請日: 2021-08-12
• 公開（公告）號: CN113684166B
• 公開（公告）日: 2023-07-04
• 發明（設計）人: 康振;王陽;胡立濤;陳堅;堵國成;劉京京;孫婕妤
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12P19/04;C12R1/15
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 林娟

1.一種用于合成軟骨素寡聚糖的重組谷氨酸棒桿菌，其特征在于，異源表達軟骨素合酶從而構建軟骨素的合成途徑，異源表達N-乙酰葡萄糖胺差向異構酶和強化前體物質UDP-N-乙酰半乳糖胺和/或UDP-葡萄糖醛酸的合成途徑的酶的表達以促進軟骨素的合成，并表達軟骨素裂解酶用于將軟骨素裂解為軟骨素寡聚糖；所述谷氨酸棒桿菌為谷氨酸棒桿菌ATCC?13032；

所述軟骨素合酶的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示；

所述N-乙酰葡萄糖胺差向異構酶的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.3所示；

所述軟骨素裂解酶的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.4所示；

所述強化前體物質UDP-N-乙酰半乳糖胺和/或UDP-葡萄糖醛酸的合成途徑的酶為谷氨酰胺-果糖-6-磷酸氨基轉移酶、磷酸葡萄糖變位酶、UDP-N-乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶/葡萄糖-1-磷酸乙酰轉移酶雙功能酶、磷酸葡萄糖變構酶、葡萄糖-6-磷酸尿酰胺轉移酶和UDP-葡萄糖脫氫酶；

所述谷氨酰胺-果糖-6-磷酸氨基轉移酶的NCBI?reference?sequence為WP_012514860.1，所述磷酸葡萄糖變構酶GlmM的NCBI?reference?sequence為WP_012677779.1，所述UDP-N-乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶/葡萄糖-1-磷酸乙酰轉移酶雙功能酶GlmU的NCBI?reference?sequence為WP_012677301.1，所述UDP-葡萄糖脫氫酶UgdA的NCBIreference?sequence為WP_012677300.1，所述谷氨酰胺-果糖-6-磷酸氨基轉移酶GlmS的NCBI?reference?sequence為WP_012514860.1。

2.根據權利要求1所述的一種用于合成軟骨素寡聚糖的重組谷氨酸棒桿菌，其特征在于，所述的軟骨素裂解酶N端融合了麥芽糖促融標簽，且軟骨素裂解酶N端前5個氨基酸序列進行了截短突變。

3.根據權利要求1或2所述的一種用于合成軟骨素寡聚糖的重組谷氨酸棒桿菌，其特征在于，將編碼軟骨素合酶、編碼前體物質UDP-N-乙酰葡萄糖胺和UDP-葡萄糖醛酸合成途徑的基因及編碼軟骨素裂解酶的基因與載體連接或者整合至谷氨酸棒桿菌基因組上進行表達。

4.根據權利要求3所述的一種用于合成軟骨素寡聚糖的重組谷氨酸棒桿菌，其特征在于，所述載體包括以下任一種：pXMJ19、pECXK99E、pEC-XT99A、pEKEx1、pEKEx2、pVWEx1、pVWEx2、pZ8-1、pECTAC-K99、pAPE12；基因組整合位點包括基因組上任何非必需基因位點。

5.一種生產軟骨素寡聚糖的方法，其特征在于，應用權利要求1~4任一所述的重組谷氨酸棒桿菌進行發酵培養；所述發酵培養指的是在含有碳源、氮源、無機鹽、金屬離子和氧氣的環境中，于10~45℃的條件下進行發酵培養，培養周期在8-240?h之間；在發酵過程補料流加碳源、氮源、無機鹽、金屬離子等營養物質。

6.權利要求1~4任一所述重組谷氨酸棒桿菌在制備軟骨素及其衍生產品方面的應用。