[發(fā)明專利]豬源性抗豬流行性腹瀉病毒N蛋白的真核表達(dá)單鏈抗體及其制備方法和用途

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110922550.9
• 申請(qǐng)日: 2021-08-12
• 公開（公告）號(hào): CN113683689B
• 公開（公告）日: 2023-01-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 朱建國(guó);王鳳青;張蕾;程曼玲
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海交通大學(xué)
• 主分類號(hào): C07K16/10
• 分類號(hào): C07K16/10;C12N15/13;C12N15/85;A61K39/42;A61P31/14
• 代理公司: 上海交達(dá)專利事務(wù)所 31201
• 代理人: 王毓理;王錫麟

一種豬源性抗豬流行性腹瀉病毒N蛋白的真核表達(dá)單鏈抗體及其制備方法和用途，該真核表達(dá)單鏈抗體包含豬源單鏈抗體片段VH?Linker?VL，其中：豬抗體重鏈可變區(qū)VH的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，豬抗體輕鏈可變區(qū)VL的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，Linker為中間連接肽。能夠與豬流行性腹瀉病毒N蛋白特異性結(jié)合，可抑制豬流行性腹瀉病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制，能夠用于制備防治豬流行性腹瀉藥物的研究。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及的是一種基因工程領(lǐng)域的技術(shù)，具體是一種豬源性抗豬流行性腹瀉病毒N蛋白的真核表達(dá)單鏈抗體及其制備方法和用途。

背景技術(shù)

豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea，PED)是由豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrheavirus，PEDV)感染豬引起的臨床表現(xiàn)為腹瀉、嘔吐、脫水甚至死亡的一種腸道疾病。PED的傳染性強(qiáng)，發(fā)病率高，感染后的新生仔豬的死亡率甚至高達(dá)100％，該病在全球多個(gè)國(guó)家均有爆發(fā)，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，影響全世界養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。疫苗接種是預(yù)防病毒性疾病的一種有效方法，但是由于PEDV的變異速度快，商業(yè)化疫苗對(duì)變異毒株的預(yù)防效果并不理想。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，提出一種豬源性抗豬流行性腹瀉病毒N蛋白的真核表達(dá)單鏈抗體及其制備方法和用途，能夠與豬流行性腹瀉病毒N蛋白特異性結(jié)合，可抑制豬流行性腹瀉病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制，能夠用于制備防治豬流行性腹瀉藥物的研究。

本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

本發(fā)明涉及一種真核表達(dá)單鏈抗體，包含豬源單鏈抗體片段VH-Linker-VL，其中：豬抗體重鏈可變區(qū)VH的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，豬抗體輕鏈可變區(qū)VL的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，Linker為中間連接肽。

所述的中間連接肽的核苷酸序列，如SEQ ID No.3所示。

本發(fā)明涉及上述單鏈抗體的實(shí)現(xiàn)方法，通過(guò)將豬源單鏈抗體片段VH-Linker-VL的編碼基因插入真核表達(dá)質(zhì)粒pCMV-HA，構(gòu)建成為重組真核表達(dá)質(zhì)粒pCMV-HA-scFv，將pCMV-HA-scFv轉(zhuǎn)染Vero-E6細(xì)胞。

所述的真核表達(dá)單鏈抗體，其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，其氨基酸序列如SEQ ID No.5所示。

所述的單鏈抗體的分子量大小約為28kDa。

本發(fā)明涉及上述單鏈抗體的應(yīng)用，將其用于在豬流行性腹瀉病毒感染的細(xì)胞中表達(dá)，以抑制豬流行性腹瀉病毒的復(fù)制。

所述的抑制，P0.001，具有一定的抵抗豬流行性腹瀉病毒感染的作用。

所述的應(yīng)用，具體包括：

1)采用RT-PCR直接從重組表達(dá)的豬流行性腹瀉病毒N蛋白免疫的豬脾臟組織RNA中擴(kuò)增出抗體編碼基因的重鏈可變區(qū)VH基因和輕鏈可變區(qū)VL基因；

2)利用SOE-PCR法將步驟1)得到的VH基因、中間連接肽和步驟1)得到的VL基因相連構(gòu)建豬源性單鏈抗體基因；

3)將步驟2)獲得的豬源性單鏈抗體基因克隆到原核表達(dá)載體pOPE101-XP中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pOPE101-XP-scFv；

4)將步驟3)的重組質(zhì)粒pOPE101-XP-scFv轉(zhuǎn)化入E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)過(guò)多次轉(zhuǎn)化，獲得豬源性單鏈抗體庫(kù)；

5)從步驟4)構(gòu)建的豬源性單鏈抗體庫(kù)中隨機(jī)挑取單克隆，制備周質(zhì)腔蛋白，以豬流行性腹瀉病毒N蛋白作為包被抗原進(jìn)行ELISA篩選，有陽(yáng)性反應(yīng)的相對(duì)應(yīng)的陽(yáng)性克隆即含有抗豬流行性腹瀉病毒N蛋白的真核表達(dá)單鏈抗體。

技術(shù)效果