[發(fā)明專利]一種天冬酰胺酶突變體及其基因、工程菌和制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110915041.3
• 申請日: 2021-08-10
• 公開（公告）號: CN113604457B
• 公開（公告）日: 2022-08-30
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉逸寒;康宏偉;王鳳華;路福平
• 申請（專利權(quán)）人: 天津科技大學(xué)
• 主分類號: C12N9/82
• 分類號: C12N9/82;C12N15/55;C12N15/75;C12N1/21;C12R1/125;C12R1/07;C12R1/10
• 代理公司: 北京瑞盛銘杰知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11617
• 代理人: 栗華楠

本發(fā)明屬于酶的基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種酶活力提高的L?天冬酰胺酶突變體及其制備。本發(fā)明通過分子生物學(xué)技術(shù)手段獲得蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)野生型的L?天冬酰胺酶基因，利用易錯PCR技術(shù)對野生型L?天冬酰胺酶基因進行隨機突變，得到L?天冬酰胺酶突變體Y55S/I203V、H8R/Y55S/I203V，及其編碼基因asnm1、asnm2，重新構(gòu)建重組質(zhì)粒，并實現(xiàn)了其在枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌中的高效表達，通過發(fā)酵、提取等技術(shù)獲得高活力的L?天冬酰胺酶。

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明屬于酶的基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及通過易錯PCR技術(shù)體外定向進化獲得酶活力提高的L-天冬酰胺酶突變體及其制備與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

L-天冬酰胺酶(L-Asparaginase；EC 3.5.1.1；ASN)是專一催化L-天冬酰胺水解脫氨基生成L-天冬氨酸和氨的一種水解酶。大多數(shù)天冬酰胺酶具有3％-9％的谷氨酰胺酶活性，催化L-谷氨酰胺水解成L-谷氨酸和氨。L-天冬酰胺酶來源比較廣泛，豚鼠血清、植物以及微生物中都發(fā)現(xiàn)該酶的存在。L-天冬酰胺酶有L-天冬酰胺酶I和L-天冬酰胺酶II這兩種不同的構(gòu)型。I型酶的結(jié)構(gòu)為二聚體，一般在細胞內(nèi)且對底物具有低親和力；而II型酶為四聚體，位于細胞周質(zhì)對底物具有高親和力，研究表明只有II型酶具有抗腫瘤活性。L-天冬酰胺酶通過催化反應(yīng)使機體內(nèi)的L-天冬酰胺含量下降。機體內(nèi)惡性細胞合成L-天冬酰胺的能力比正常細胞緩慢，并且需要外源補給，而正常的細胞因為具有合成L-天冬酰胺的能力，當外界L-天冬酰胺含量下降時可以不受影響。如今，L-天冬酰胺酶現(xiàn)已經(jīng)被制成藥劑，成為抗癌新藥之一，美國、日本以及德國等國家均已經(jīng)有該酶產(chǎn)品出售。從E.coli，Erwiniachrysanthemi等細菌中分離純化的L-天冬酰胺酶II已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于治療急性淋巴細胞白血病，淋巴肉瘤及網(wǎng)狀細胞肉瘤等疾病。此外，近年來研究發(fā)現(xiàn)L-天冬酰胺酶還可以減少油炸食品中丙烯酰胺的生成。1994年國際癌癥機構(gòu)(IARC)證明丙烯酰胺具有致癌作用。在磷酸鹽緩沖液中加入一定量的葡萄糖和L-天冬酰胺并在185℃反應(yīng)，測定結(jié)果表明有大量丙烯酰胺生成。碳水化合物豐富的食物加工溫度高于120℃，分析檢測其丙烯酰胺含量為1mg/kg，餐館食物中的丙烯酰胺含量可以達到4mg/kg。美拉德反應(yīng)與加工食品風味物質(zhì)及色澤形成有關(guān)。食品加工過程中丙烯酰胺的形成是通過美拉德反應(yīng)產(chǎn)生的，氨基酸和還原糖在高溫下會發(fā)生美拉德反應(yīng)，而且L-天冬酰胺可以提供氨基，土豆及其他谷物中的L-天冬酰胺是生成丙烯酰胺的重要前體。2008研究報道表明，卵巢癌、子宮癌、乳腺癌及腎腫瘤的發(fā)病率提高與長期食用高含量丙烯酰胺的食物有關(guān)系。因此，學(xué)者們致力于減少食物中丙烯酰胺的形成，相關(guān)報道也越來越多。

對酶分子的設(shè)計與改造方面，是基于基因工程、蛋白質(zhì)工程和計算機技術(shù)互補發(fā)展和滲透的結(jié)果，它標志著人類可以按照自己的意愿和需要改造酶分子，甚至設(shè)計出自然界中原來并不存在的全新的酶分子。酶分子人為改造還不成熟的情況下，通過定點突變技術(shù)改造成功了大量的酶分子，獲得了比天然酶活力更高、穩(wěn)定性更好的工業(yè)用酶。近年來，易錯PCR、DNA改組(DNA shuffling)等技術(shù)的應(yīng)用，在對目的基因表型有高效檢測篩選系統(tǒng)的條件下，建立了酶分子的定向進化策略，盡管不清楚酶分子的結(jié)構(gòu)，仍能獲得具有預(yù)期特性的新酶，基本實現(xiàn)了酶分子的人為快速進化。

芽孢桿菌表達系統(tǒng)作為一種安全、高效、多功能和極具開發(fā)潛力的微生物菌種已廣泛地應(yīng)用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、衛(wèi)生、食品、畜牧業(yè)、水產(chǎn)及科研領(lǐng)域。它與常用的大腸桿菌表達系統(tǒng)相比有著獨特的優(yōu)勢，即可將目的基因表達的產(chǎn)物分泌到胞外，從而降低進一步收集、分離、純化基因表達產(chǎn)物的成本和工作量。芽孢桿菌中枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌等均可作為表達宿主菌。在微生物遺傳學(xué)領(lǐng)域，芽孢桿菌屬背景研究也十分清楚，具有密碼子偏愛性不明顯、發(fā)酵簡單、生長迅速、不產(chǎn)生致病毒素、對培養(yǎng)基無特殊要求等優(yōu)點。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展和芽孢桿菌研究的深入，使用芽孢桿菌表達系統(tǒng)已經(jīng)克隆和表達了大量基因，有些已進行大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)，多種酶和臨床需要的化學(xué)藥品或者工業(yè)產(chǎn)品都通過芽孢桿菌來表達生產(chǎn)。