[發明專利]促進tshs、yncE基因胞外表達的質粒及其構建方法和應用

有效

• 申請號: 202110911262.3
• 申請日: 2021-08-10
• 公開（公告）號: CN113736811B
• 公開（公告）日: 2023-07-18
• 發明（設計）人: 楊鍇;賈琳;石虎;王曉波;牛志勇;馬興樹;陳淑芳;崔一
• 申請（專利權）人: 河北科星藥業有限公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/31;C12N1/21;A61K39/108;A61P31/04;C12R1/19
• 代理公司: 石家莊科誠專利事務所(普通合伙) 13113
• 代理人: 劉蘭芳;蘇興娟

1.一種促進tsh_s、yncE基因胞外表達的質粒的構建方法，其特征在于，它按照如下的步驟依次進行：

S1.?目的基因的克隆

以禽致病性大腸桿菌基因為模板，利用引物分別擴增tsh基因、bor基因和yncE基因，其中，引物序列如下：

tsh基因上游引物：5’-CCGGAATTCGATGAACAGAATTTATTCTCTTCGC-3’，

tsh基因下游引物：5’-CCCAAGCTTTCAGAATGAATAACGAATATTAGCGT-3’；

bor基因上游引物：5’-GGAAGATCTTAGGATTCTGCCGTTTTTA-3’，

bor基因下游引物：5’-CCGCTCGAGCATATCGATGGGCAACTA-3’；

yncE基因上游引物：5’-CGGGATCCGATGCATTTACGTCATCTGTTTT-3’，

yncE基因下游引物：5’-ATTTGCGGCCGCTTACAGCGCAATACGAATCAC-3’；

S2.?yncE基因連接pETDuet-1質粒

將S1擴增所得的yncE基因連接至克隆載體，經轉化，篩選陽性克隆，酶切回收帶有酶切位點的yncE基因并連接入pETDuet-1質粒，經轉化，篩選陽性克隆，提取pETDuet-1/yncE質粒作模板，利用引物擴增yncE2基因；

其中，yncE2基因上游引物序列：5’-ACATGCATGCATGCGTCCGGCGTAGAGG-3’，

yncE2基因下游引物序列：5’-ACATGCATGCACCCCTCAAGACCCGTTTAG-3’；

S3.?tsh基因和bor基因連接pETDuet-1質粒

將S1擴增所得的tsh基因和bor基因分別連接至克隆載體，經轉化，篩選陽性克隆，分別酶切回收帶有酶切位點的tsh基因和bor基因并依次連接入pETDuet-1質粒，經轉化，篩選陽性克隆，提取pETDuet-1/tsh/bor質粒；

S4.?yncE2基因連接pETDuet-1/tsh/bor質粒

將S2擴增所得的yncE2基因連接至克隆載體，經轉化，篩選陽性克隆，酶切回收帶有酶切位點的yncE2基因并連接入pETDuet-1/tsh/bor質粒，經轉化，篩選yncE2基因與tsh基因和bor基因序列方向相反的克隆，提取pETDuet-1/tsh/bor/yncE2質粒，即為促進tsh_s、yncE基因胞外表達的質粒。