[發明專利]含有AIF1細胞因子抗體的小球藻及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 202110911255.3
• 申請日: 2021-08-10
• 公開（公告）號: CN113699046A
• 公開（公告）日: 2021-11-26
• 發明（設計）人: 吳信忠;蔡小輝
• 申請（專利權）人: 吳信忠
• 主分類號: C12N1/13
• 分類號: C12N1/13;C12N15/87;C07K16/18;C07K16/06;C07K1/22;A23K50/80;A23K10/30;C12R1/89
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司 33212
• 代理人: 朱瑩瑩;周世駿

本發明屬于生物技術領域，涉及含有AIF1細胞因子抗體的小球藻及其制備方法和應用。本發明采用純化出來的近江牡蠣AIF1細胞因子抗體蛋白制品標記FITC熒光標記，以pVEC穿膜肽為載體將AIF1細胞因子抗體蛋白分子導入小球藻，在室溫黑暗條件下，進行AIF1細胞因子抗體孵育小球藻，從而獲得含有AIF1細胞因子抗體分子物質成分的小球藻種類。用抗體分子免疫熒光標記生物學技術、激光共聚焦顯微鏡檢測、驗證小球藻體內含有牡蠣AIF1細胞因子抗體蛋白質成分及其含量。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及含有AIF1細胞因子抗體的小球藻及其制備方法和應用。

背景技術

“藍色海洋產業”是當今人類解決人口過剩與陸地資源短缺這一矛盾的重要源泉，但隨著海水養殖產業(包括貝類、蝦類和魚類養殖產業)的發展，海水養殖病害的暴發和流行給海水養殖產業的發展以極大的打擊，成為這一產業發展的“瓶頸”制約因素。因此，人們迫切地需要解決下列兩個重大的問題：即病害的“防”與“治(或曰控制)”，而解決“防”與“控制”的關鍵就是：一要解決流行病的快速檢測問題，做到疾病暴發前的早診斷；二要解決養殖動物自身抵抗力的問題即免除病原感染，降低養殖動物群體的大規模死亡。國際上應用分子生物學技術(包括分子免疫學)防治海水養殖動物病害是當今國內外海水養殖病害研究的主攻發展方向，這些技術包括各種分子及免疫快速檢測技術、各種分子疫苗技術、各種細胞或免疫因子、基因工程技術等。但是，目前國內外尚未有采用高效價細胞因子抗體技術來獲得貝類、蝦類和魚類養殖產業生產中抗病的免疫餌料及抗菌微生態免疫制劑制備的技術和產品。

我們前期對AIF1對革蘭氏陰性菌成份LPS和類立克次氏體(RLO)抗感染的研究顯示：牡蠣AIF1(Ca-AIF1)多克隆兔抗血清能顯著抑制類立克次氏體(RLO)和LPS刺激引起的炎癥相關因子LITAF的表達(LPS+anti-Ca-AIF1，1.5-12小時分別降低70.95％，84.18％，39.49％和87.53％；RLO+anti-Ca-AIF1，1.5-12小時分別降低88.57％，84.80％，59.36％和59.16％)，說明Ca-AIF1多克隆抗血清具有有效抑制RLO感染和革蘭氏陰性菌引起的炎癥反應的作用。再比如，Ca-AIF1抗血清能夠顯著抑制RLO感染和革蘭氏陰性菌引起的細胞凋亡和細胞壞死，顯著增加細胞存活率，RLO+anti-Ca-AIF1實驗組和LPS+anti-Ca-AIF1實驗組活細胞數分別增加了51％和49％；而晚期凋亡細胞率分別減少了約50％和18％。

發明內容

針對上述現有技術中存在的缺乏，本發明提供了含有AIF1細胞因子抗體馴化培養小球藻及其制備方法。

一種含有AIF1細胞因子抗體的小球藻。

含有AIF1細胞因子抗體的小球藻的制備方法，采用純化出來的近江牡蠣AIF1細胞因子抗體蛋白制品標記FITC熒光標記，以pVEC穿膜肽為載體將AIF1細胞因子抗體蛋白分子導入小球藻，在室溫黑暗條件下，進行AIF1細胞因子抗體孵育小球藻，從而獲得含有AIF1細胞因子抗體的小球藻。

其中，AIF1細胞因子抗體的制備包括如下步驟：

1)以近江牡蠣血淋巴細胞總RNA為模板，反轉錄成一鏈cDNA，克隆獲得AIF1基因的編碼框核苷酸序列；

2)將AIF1基因編碼框的序列片段克隆到pMD19-T載體中，再經限制性內切酶酶切，與經同樣酶切的pET-32(a)原核表達載體連接，獲得重組表達質粒pET-32(a)-AIF1；

3)將陽性重組質粒PET-32(a)-AIF1轉化到表達宿主菌E.coli Rossetta(DE3)，異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導表達，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進行檢測；

4)將陽性表達菌液擴大培養，利用蛋白質純化試劑盒分離純化重組蛋白質；

5)將純化的AIF1蛋白多點注射新西蘭大白兔，制備純化多克隆抗體。