[發明專利]含AIF1細胞因子抗體的金鞭藻及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 202110911254.9
• 申請日: 2021-08-10
• 公開（公告）號: CN113717858A
• 公開（公告）日: 2021-11-30
• 發明（設計）人: 吳信忠;蔡小輝
• 申請（專利權）人: 吳信忠
• 主分類號: C12N1/13
• 分類號: C12N1/13;C07K16/24;C12N15/79;A23K10/18;A23K50/80;C12R1/89
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司 33212
• 代理人: 朱瑩瑩;周世駿

本發明屬于生物技術領域，涉及含AIF1細胞因子抗體的金鞭藻及其制備方法和應用。本發明采用純化出來的近江牡蠣AIF1細胞因子抗體蛋白制品標記FITC熒光標記，以pVEC穿膜肽為載體將AIF1細胞因子抗體蛋白分子導入金鞭藻，在室溫黑暗條件下，進行AIF1細胞因子抗體孵育金鞭藻，從而獲得含有AIF1細胞因子抗體分子物質成分的金鞭藻種類。采用抗體分子免疫熒光標記生物學技術、激光共聚焦顯微鏡檢測、驗證金鞭藻體內含有牡蠣AIF1細胞因子抗體蛋白質成分及其含量。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及含AIF1細胞因子抗體的金鞭藻及其制備方法和應用。

背景技術

我國是世界水產養殖大國，總產量連續多年位于世界首位，但由于我國水產養殖規模化、集約化不斷擴大，致使養殖水環境逐年惡化，病害暴發嚴重，根據中國科協發布的《病蟲害防治綠皮書》，我國水產養殖病害平均年損失超百億元之巨。同時，長期不科學的濫用漁藥，使得致病微生物的耐藥性不斷增強，藥物殘留量超標問題等日益突出，這也成為我國人民飲食產品安全與健康的重要問題。上述病害的嚴重高發和化學藥物及抗生素的濫用，嚴重阻礙了我國水產養殖產業的發展，水產動物病害的合理、有效防控成為我國水產養殖業可持續健康發展的核心問題。

我們前期對AIF1對革蘭氏陰性菌成份LPS和類立克次氏體(RLO)抗感染的研究顯示：牡蠣AIF1(Ca-AIF1)多克隆兔抗血清能顯著抑制類立克次氏體(RLO)和LPS刺激引起的炎癥相關因子LITAF的表達(LPS+anti-Ca-AIF1，1.5-12小時分別降低70.95％，84.18％，39.49％和87.53％；RLO+anti-Ca-AIF1，1.5-12小時分別降低88.57％，84.80％，59.36％和59.16％)，說明Ca-AIF1多克隆抗血清具有有效抑制RLO感染和革蘭氏陰性菌引起的炎癥反應的作用。再比如，Ca-AIF1抗血清能夠顯著抑制RLO感染和革蘭氏陰性菌引起的細胞凋亡和細胞壞死，顯著增加細胞存活率，RLO+anti-Ca-AIF1實驗組和LPS+anti-Ca-AIF1實驗組活細胞數分別增加了51％和49％；而晚期凋亡細胞率分別減少了約50％和18％。

發明內容

針對上述現有技術中存在的缺乏，本發明提供了AIF1細胞因子抗體馴化培養金鞭藻及其貝類及魚蝦病害抗感染防治的免疫抗病餌料應用。

一種含有AIF1細胞因子抗體的金鞭藻。

含有AIF1細胞因子抗體的金鞭藻的制備方法，采用純化出來的近江牡蠣AIF1細胞因子抗體蛋白制品標記FITC熒光標記，以pVEC穿膜肽為載體將AIF1細胞因子抗體蛋白分子導入金鞭藻，在室溫黑暗條件下，進行AIF1細胞因子抗體孵育金鞭藻，從而獲得含有AIF1細胞因子抗體的金鞭藻。

AIF1細胞因子抗體的制備包括如下步驟：

1)以近江牡蠣血淋巴細胞總RNA為模板，反轉錄成一鏈cDNA，克隆獲得AIF1基因的編碼框核苷酸序列；

2)將AIF1基因編碼框的序列片段克隆到pMD19-T載體中，再經限制性內切酶酶切，與經同樣酶切的pET-32(a)原核表達載體連接，獲得重組表達質粒pET-32(a)-AIF1；

3)將陽性重組質粒PET-32(a)-AIF1轉化到表達宿主菌E.coli Rossetta(DE3)，異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導表達，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進行檢測；

4)將陽性表達菌液擴大培養，利用蛋白質純化試劑盒分離純化重組蛋白質；

5)將純化的AIF1蛋白多點注射新西蘭大白兔，制備純化多克隆抗體。

其中，AIF1細胞因子抗體蛋白分子導入金鞭藻包括如下步驟：

1)AIF1細胞因子抗體純化及綠色熒光標記