[發明專利]一種活性菊黃東方鲀魚皮多肽及其制備方法、應用

有效

• 申請號: 202110910669.4
• 申請日: 2021-08-09
• 公開（公告）號: CN113603745B
• 公開（公告）日: 2023-07-07
• 發明（設計）人: 蘇永昌;劉智禹;劉淑集;陳貝;喬琨;許旻;陳曉婷
• 申請（專利權）人: 福建省水產研究所（福建水產病害防治中心）
• 主分類號: C07K7/06
• 分類號: C07K7/06;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/22;C12P21/06;B01D15/20;B01J20/24;B01J20/28;B01J20/30;A61K38/08;A61P9/12;A61P3/10
• 代理公司: 廈門律嘉知識產權代理事務所(普通合伙) 35225
• 代理人: 張輝;溫潔

1.一種活性菊黃東方鲀魚皮多肽，其特征在于，

所述活性菊黃東方鲀魚皮多肽為十肽，氨基酸序列：TLRFALHGME。

2.一種活性菊黃東方鲀魚皮多肽制備方法，其特征在于，

包括以下步驟：

S0：固定化ACE凝膠親和吸附柱的制備；

S1：肽組分的制備，取菊黃東方鲀鮮魚皮，絞碎后加入水，勻漿形成魚皮漿料液，加入蛋白酶進行酶解，采用酶活力單位為5萬U/g的堿性蛋白酶進行酶解，酶解條件為堿性蛋白酶添加量為魚皮漿料液質量的0.8-1.2％，pH值為7.8-8.2，酶解溫度為58-62℃，酶解時間為5.8-6.2h，酶解后進行滅酶處理，冷卻后調節pH值至中性，得酶解液，對酶解液進行微濾，然后進行超濾處理，獲得分子量小于1kDa的肽組分；

S21：在中壓蛋白純化儀上，安裝好所述步驟S0制得的固定化ACE凝膠親和吸附柱，用摩爾濃度為0.08-0.12M、pH為7.9-8.1的硼酸鹽緩沖液進行平衡18-22min，平衡流速0.45-0.55mL/min，并在紫外檢測儀檢測，紫外檢測波長為220nm；

S22：平衡后進行所述步驟S1獲得的分子量小于1kDa的肽組分的上樣吸附，上樣量4.5-5.5mL，流動相用摩爾濃度為0.08-0.12M、pH為7.9-8.1的硼酸鹽緩沖液，流速0.45-0.55mL/min，觀察至檢測基線平穩后14-16min，以摩爾濃度為0.08-0.12M、pH為7.9-8.1的硼酸鹽緩沖液為洗脫流動相進行洗脫，且硼酸鹽緩沖液含有0.8-1.2M的NaCl，洗脫流速0.45-0.55mL/min，收集洗脫峰組分；

S23:固定化ACE凝膠親和吸附柱用摩爾濃度為0.08-0.12M、pH為7.9-8.1的硼酸鹽緩沖液重新進行平衡18-22min后，按步驟S22進行多次的肽組分上樣和洗脫，將多次洗脫峰組分合并，采用截留分子量為100D的透析袋對洗脫峰組分進行脫鹽，減壓濃縮后待用；

S3：肽的序列鑒定，對步驟S2減壓濃縮后的洗脫峰組分進行質譜測定，采用LC-MS/MS進行質譜測定，測定條件為：色譜柱為PepMap?RPLC?C₁₈,75μm?i.d.×150mm,3μm，陽離子模式，掃描范圍：m/z?300-1500Da，發射極噴霧電壓2-kV，質譜測定的結果用PEAKS?STUDIO軟件進行分析，得到其中一條活性菊黃東方鲀魚皮多肽的氨基酸序列為TLRFALHGME；

S4：將活性菊黃東方鲀魚皮多肽TLRFALHGME按步驟S3測定的氨基酸序列進行固相合成，驗證合成活性菊黃東方鲀魚皮多肽的ACE抑制活性。

3.根據權利要求2所述的活性菊黃東方鲀魚皮多肽制備方法，其特征在于，

所述步驟S0的具體步驟：

S01：將ACE溶解于硼酸鹽緩沖液制得ACE螯合配體溶液；

S02：往溴化氰活化瓊脂糖凝膠4B中加入稀鹽酸進行溶脹，過濾后用硼酸鹽緩沖液清洗、濾干，除去殘余HCl，得溴化氰活化瓊脂糖4B填料；

S03：將ACE螯合配體溶液與溴化氰活化瓊脂糖4B填料混合，攪拌均勻后螯合過夜，螯合后，用4-6倍溴化氰活化瓊脂糖4B填料體積的硼酸鹽緩沖液進行清洗和過濾，除去多余的ACE；

S04：將濾干后的溴化氰活化瓊脂糖4B填料與Tris-HCl緩沖液混勻，進行輕柔振蕩后過濾；

S05：過濾后，采用醋酸鹽緩沖液和Tris-HCl緩沖液交替清洗過濾3-5次，得ACE固定化凝膠填料，將ACE固定化凝膠填料懸浮于硼酸鹽緩沖液，裝填入層析柱，即為固定化ACE凝膠親和吸附柱。