[發(fā)明專利]一種靶向PD-L1胞外片段的DNA適配體

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110905999.4
• 申請(qǐng)日: 2021-08-09
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN113667672A
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-11-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃必勝;胡詠武
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 優(yōu)葆優(yōu)保健康科技（寧波）有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/115
• 分類號(hào): C12N15/115;C12N15/10
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

1.一種靶向PD-L1胞外片段的DNA適配體，其特征在于：該適配體是通過(guò)采用Whole-Cell SELEX，WCS技術(shù)篩選方法篩選出的核酸適配體PD-L1-Aptamer，利用前期構(gòu)建的陰性選擇細(xì)胞系PDL-1-KO癌細(xì)胞系，經(jīng)20-30輪循環(huán)，篩選出特異性高、結(jié)合緊密的PD-L1-Aptamer；

所述Whole-Cell SELEX，WCS技術(shù)篩選方法具體包括以下步驟：

S1、設(shè)計(jì)并合成一個(gè)含52個(gè)隨機(jī)序列的核酸庫(kù)，每個(gè)隨機(jī)序列由兩端已知的引物區(qū)和中間隨機(jī)區(qū)組成；

S2、將步驟S1設(shè)計(jì)的隨機(jī)核酸庫(kù)與目標(biāo)生物靶點(diǎn)孵育，形成核酸適配體-靶點(diǎn)復(fù)合體；

S3、將與靶點(diǎn)結(jié)合的核酸適配體與其他核酸分子通過(guò)合適的方法分離；

S4、將與靶點(diǎn)結(jié)合的核酸適配體通過(guò)PCR擴(kuò)增，形成一個(gè)富集的次級(jí)核酸庫(kù)，將其與靶點(diǎn)重新孵育，進(jìn)行下一輪篩選；

S5、經(jīng)過(guò)8-20輪篩選，當(dāng)富集程度達(dá)到飽和后，對(duì)富集的核酸庫(kù)進(jìn)行測(cè)序分析，鑒定特異性核酸適配體序列；

S6、通過(guò)采用構(gòu)建的PD-L1-KO細(xì)胞系，隨機(jī)挑選100個(gè)克隆一代測(cè)序和PCR產(chǎn)物直接高通量測(cè)序相結(jié)合，分析篩選得到的Aptamer序列，并純化獲得更多的Aptamer分子，然后與野生型腫瘤細(xì)胞和基因敲除細(xì)胞系做親和度和特異性檢測(cè)，選取最優(yōu)序列的Aptamer分子；

S7、將最優(yōu)Aptamer進(jìn)行熒光化學(xué)基團(tuán)修飾，與各類腫瘤細(xì)胞系結(jié)合，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的檢出率，確定PDL-1Aptamer與腫瘤細(xì)胞的親和力；

S8、研究篩選出來(lái)的PD-L1-Aptamer在野生型腫瘤細(xì)胞系中的作用，將篩選出來(lái)的PD-L1-Aptamer加入培養(yǎng)的各種野生型腫瘤細(xì)胞系與NK細(xì)胞混合培養(yǎng)，觀察其對(duì)腫瘤細(xì)胞的影響，分析其作為靶向治療的潛力，或?qū)⑵涓脑斐蓴y帶各種藥物靶向腫瘤細(xì)胞的治療方法。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種靶向PD-L1胞外片段的DNA適配體，其特征在于：所述步驟S1中DNA適配體序列具體如下：

PD-L1-Aptamer 1consisting of 52bases.

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PD-L1-Aptamer 2consisting of 52bases.

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PD-L1-Aptamer 3consisting of 52bases.

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PD-L1-Aptamer 4consisting of 52bases.

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PD-L1-Aptamer 5consisting of 52bases.

tcggcaatacccttgcgtcgtgcgagactaattctgctgtgttcattaaacc

PD-L1-Aptamer 6consisting of 52bases.

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PD-L1-Aptamer 7consisting of 52bases.

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PD-L1-Aptamer8 consisting of 52bases.

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PD-L1-Aptamer 9consisting of 52bases.

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PD-L1-Aptamer 10consisting of 52bases.

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