[發(fā)明專利]一種利用抗凍蛋白-內(nèi)含肽作為純化標(biāo)簽實(shí)現(xiàn)重組蛋白純化的方法和應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110904167.0
• 申請日: 2021-08-06
• 公開（公告）號: CN113481230A
• 公開（公告）日: 2021-10-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王從綱;孫佳明;李明玉;鄭延蓉;龐焦;李憲臻
• 申請（專利權(quán)）人: 李憲臻
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/62;C07K19/00;C07K1/14;C12N9/10
• 代理公司: 大連東方專利代理有限責(zé)任公司 21212
• 代理人: 周媛媛;李馨

1.一種利用抗凍蛋白-內(nèi)含肽作為純化標(biāo)簽實(shí)現(xiàn)外源重組蛋白分離純化的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

(1)構(gòu)建含有抗凍蛋白-內(nèi)含肽純化標(biāo)簽的基因和待分離純化的外源重組蛋白基因的重組表達(dá)載體，將該重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主細(xì)胞，獲得重組工程菌；

(2)培養(yǎng)所述重組工程菌，誘導(dǎo)外源重組蛋白表達(dá)；

(3)收集菌體細(xì)胞并進(jìn)行細(xì)胞破碎，將細(xì)胞破碎上清液稀釋后加入到在圓底燒瓶中制備的冰殼表面，利用冰作為吸附介質(zhì)從細(xì)胞破碎上清液中一步分離純化帶有抗凍蛋白-內(nèi)含肽純化標(biāo)簽的融合蛋白；

(4)將吸附有融合蛋白的冰殼表面清洗后融化，加入斷裂反應(yīng)緩沖液，誘導(dǎo)內(nèi)含肽的N端發(fā)生斷裂反應(yīng)，得到純化標(biāo)簽和目的蛋白的混合物；

(5)透析后再次加到新的冰殼表面，利用冰吸附去除抗凍蛋白-內(nèi)含肽純化標(biāo)簽，得到純化后的外源重組蛋白。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗凍蛋白基因?yàn)槟蠘O魚Lycodichthyus dearborni來源的抗凍蛋白基因經(jīng)密碼子優(yōu)化所得，具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述內(nèi)含肽基因來自蟾分枝桿菌Mycobacterium xenopi gyrA經(jīng)過N198A突變，存在于商品化質(zhì)粒載體pTWIN1上，具有SEQID NO.2所示的核苷酸序列。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)中抗凍蛋白-內(nèi)含肽純化標(biāo)簽的基因?yàn)槿鏢EQ ID NO.8所示的核苷酸序列。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)中所述表達(dá)宿主細(xì)胞包括大腸桿菌E.coli BL21(DE3)。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(4)中的斷裂反應(yīng)緩沖液中帶有斷裂反應(yīng)時(shí)終濃度為40mM的二硫蘇糖醇。

7.一種權(quán)利要求1-6中任意一項(xiàng)所述的外源重組蛋白分離純化的方法在制備工業(yè)用酶制劑、蛋白質(zhì)和多肽藥物中的應(yīng)用。