[發明專利]一種利用抗凍蛋白-內含肽作為純化標簽實現重組蛋白純化的方法和應用在審
| 申請號： | 202110904167.0 | 申請日： | 2021-08-06 |
| 公開（公告）號： | CN113481230A | 公開（公告）日： | 2021-10-08 |
| 發明（設計）人： | 王從綱;孫佳明;李明玉;鄭延蓉;龐焦;李憲臻 | 申請（專利權）人： | 李憲臻 |
| 主分類號： | C12N15/70 | 分類號： | C12N15/70;C12N15/62;C07K19/00;C07K1/14;C12N9/10 |
| 代理公司： | 大連東方專利代理有限責任公司 21212 | 代理人： | 周媛媛;李馨 |
| 地址： | 116000 遼*** | 國省代碼： | 遼寧;21 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 利用 蛋白 內含 作為 純化 標簽 實現 重組 方法 應用 | ||
1.一種利用抗凍蛋白-內含肽作為純化標簽實現外源重組蛋白分離純化的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：
(1)構建含有抗凍蛋白-內含肽純化標簽的基因和待分離純化的外源重組蛋白基因的重組表達載體，將該重組表達載體轉入表達宿主細胞，獲得重組工程菌；
(2)培養所述重組工程菌，誘導外源重組蛋白表達；
(3)收集菌體細胞并進行細胞破碎，將細胞破碎上清液稀釋后加入到在圓底燒瓶中制備的冰殼表面，利用冰作為吸附介質從細胞破碎上清液中一步分離純化帶有抗凍蛋白-內含肽純化標簽的融合蛋白；
(4)將吸附有融合蛋白的冰殼表面清洗后融化，加入斷裂反應緩沖液，誘導內含肽的N端發生斷裂反應，得到純化標簽和目的蛋白的混合物；
(5)透析后再次加到新的冰殼表面，利用冰吸附去除抗凍蛋白-內含肽純化標簽，得到純化后的外源重組蛋白。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗凍蛋白基因為南極魚Lycodichthyus dearborni來源的抗凍蛋白基因經密碼子優化所得，具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述內含肽基因來自蟾分枝桿菌Mycobacterium xenopi gyrA經過N198A突變，存在于商品化質粒載體pTWIN1上，具有SEQID NO.2所示的核苷酸序列。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)中抗凍蛋白-內含肽純化標簽的基因為如SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)中所述表達宿主細胞包括大腸桿菌E.coli BL21(DE3)。
6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(4)中的斷裂反應緩沖液中帶有斷裂反應時終濃度為40mM的二硫蘇糖醇。
7.一種權利要求1-6中任意一項所述的外源重組蛋白分離純化的方法在制備工業用酶制劑、蛋白質和多肽藥物中的應用。
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