[發明專利]一種用于低宿主背景干擾的核酸文庫制備方法及應用

在審

• 申請號: 202110901929.1
• 申請日: 2021-08-06
• 公開（公告）號: CN113622033A
• 公開（公告）日: 2021-11-09
• 發明（設計）人: 涂波;丁澤琴;孫梓健
• 申請（專利權）人: 成都佰維生物科技有限公司
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06;C12Q1/6869
• 代理公司: 重慶蘊博君晟知識產權代理事務所(普通合伙) 50223
• 代理人: 王玉芝

本發明涉及動物、植物及微生物靶基因的擴增技術領域，具體涉及一種用于低宿主背景干擾的核酸文庫制備方法及應用；可以改善核酸靶向測序分析技術，并可以提供準確的靶向測序、多重測序及高通量測序；可以用于對核酸的低拷貝靶基因進行測序，降低宿主高豐度核酸干擾；可用于核酸靶基因的靶向測序；可用于核酸靶基因的去除用于測序，提高檢測準確性。

技術領域

本發明涉及動物、植物及微生物靶基因的擴增技術領域，尤其涉及一種用于低宿主背景干擾的核酸文庫制備方法及應用。

背景技術

在目前涉及生物研究的技術中，從Sanger測序到以Illumina測序平臺的二代測序技術和單分子測序為主的三代測序，核酸測序技術得到了廣泛的應用。隨著測序技術的不斷發展，雖然不同的測序平臺的測序準確性及精確性不斷提高，但是對于復雜樣本中混合有大量于靶基因同源的或非同源的核酸序列帶來的污染難以消除這一難題僅從測序平臺的更迭是無法消除的。這一問題在單一物種的測序中尚能通過算法優化等方法加以克服，但對于多物種混合測序(如宏基因組測序)則會帶來無法避免的污染。

在目前對于復雜樣本靶基因測序的方法中，多種試驗實踐使用了在核酸純化、聚合酶鏈式反應及測序數據后期去除等策略進行了改進，但無可避免的會在核酸純化試劑盒的使用中造成樣本核酸提取的偏差、聚合酶鏈式反應中使用特殊引物造成部分核酸片段無法擴增或擴增結果與實際豐度偏離和靶基因被高豐度同源序列掩蓋等缺點。這些缺點最終導致了與靶序列同源性較高的核酸序列無法完全去除，靶序列的序列信息及豐度無法全部真實的獲，降低了檢測的準確性。

發明內容

本發明的目的在于提供一種用于低宿主背景干擾的核酸文庫制備方法及應用，用于核酸樣品中高豐度非靶序列的去除，同時提高低拷貝靶向基因序列在測序過程中不會被高豐度非同源核酸序列干擾，可在任意測序平臺獲得真實可靠結果，提高檢測準確性。

為實現上述目的，第一方面，本發明提供了一種用于低宿主背景干擾的核酸文庫制備方法，包括：

設計靶序列探針引物，使用聚合酶獲得核酸模板，進而獲得探針；

探針通過與靶序列進行雜交形成DNA-RNA復合體；

使用非配對核酸內切酶和單鏈特異性核酸酶切斷雜交體；

使用靶序列通用引物獲得擴增子群體進行測序文庫構建。。

在一實施方式中，所述靶序列探針引物為單一寡聚核苷酸、一系列寡聚核苷酸或修飾的寡聚核苷酸中的一種。

在一實施方式中，設計靶序列探針引物，使用聚合酶獲得核酸模板，進而獲得探針，具體包括：

使用擴增引物和核酸模板對靶向或非靶向序列進行擴增子擴增，產生一個或多個擴增子。

在一實施方式中，設計靶序列探針引物，使用聚合酶獲得核酸模板，進而獲得探針，具體還包括：

使用DNA模板用于產生靶向基因的擴增子生成探針，所述探針為DNA、RNA或DNA/RNA雜交探針。

在一實施方式中，探針通過與靶序列進行雜交形成DNA-RNA復合體，具體雜交方式為：

探針與靶標核酸通過退火方式雜交、探針與靶標核酸在緩沖液中進行雜交、探針與靶標核酸在紫外線處理下雜交、探針拴系于固體或半固體支持物上與核酸雜交、探針與拴系于固體或半固體支持物上的核酸雜交中的一種。

在一實施方式中，所述非配對核酸內切酶為T7核酸內切酶。

在一實施方式中，所述單鏈特異性核酸酶為S1核酸酶。

第二方面，本發明還提供一種用于低宿主背景干擾的核酸文庫的應用，對核酸文庫進行高通量測序。