[發明專利]調整在顯微鏡中使用的估計器的方法、計算機程序和裝置

在審

• 申請號: 202110901061.5
• 申請日: 2021-08-06
• 公開（公告）號: CN114062331A
• 公開（公告）日: 2022-02-18
• 發明（設計）人: R.施密特
• 申請（專利權）人: 阿貝里奧儀器有限責任公司
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;G02B21/00
• 代理公司: 北京市柳沈律師事務所 11105
• 代理人: 劉暢

本發明涉及一種方法、一種計算機程序和一種裝置，其用于調整在顯微鏡中使用的估計器，以用于基于在一組或多組探測位置處用光照射樣本并針對該組探測位置獲取熒光光子的方法來估計樣本中的發射體的位置。本發明還涉及一種利用這種調整方法或裝置的顯微鏡。根據本發明，樣本在一組或多組探測位置處被用光照射(S1)，并且針對該組探測位置獲取(S2)熒光光子。然后，將所獲取(S2)的光子的光子計數添加(S3)到針對該組探測位置確定的光子計數向量或光子計數總和中。隨后，從光子計數向量或光子計數總和確定(S4)代表背景噪聲的值。然后，代表背景噪聲的值用于實時調整(S5)估計器。

技術領域

本發明涉及一種用于調整在顯微鏡中使用的估計器以估計樣本中的發射體的位置的方法、計算機程序和裝置。本發明還涉及一種利用這種方法或裝置的顯微鏡。

背景技術

由于STED(STimulated Emission Depletion)[2]和RESOLFT(ReversibleSaturable Optical Fluorescence Transitions)[3]所代表的坐標定位超分辨率族(Coordinate-targeted Super-resolution family)[1]的具體優勢以及其包括PALM(Photo Activated Localization Microscopy)/STORM(Stochastic OpticalReconstruction Microscopy)[4]和PAINT(Point Accumulation for Imaging inNanoscale Topography)[5]的坐標隨機對應物的協同組合，熒光顯微鏡經歷了第二次分辨率提升。所產生的被稱為MINFLUX(Minimal photon Flux，最小光子通量)[6]的協同設計已經將普遍的分辨率差距從STED、PALM/STORM和其他熒光納米鏡中的～20-30納米縮小到分子本身的1-5納米的尺寸尺度。

在其核心，MINFLUX定位基于使用結構化光束在樣本中注入參考坐標的重要原理，例如具有中心強度最小值(即零)的圓環。樣本中的零的位置定義了目標樣本坐標。MINFLUX設計同樣適用于整組的參考坐標，即線狀和點狀零點，以及寬場中的并行檢測。坐標對準能夠良好控制地并因此具有光子效率地對熒光分子進行定位，因為不再通過建立照相機上出現的微弱的、衍射受限的熒光點的中心，來尋找待確定的熒光團坐標。替代地，熒光團是通過主動將激發圓環的零點對準到熒光團來定位的。具體地，在經過深思熟慮的迭代中，激發強度的零點盡可能接近分子，直到檢測到的熒光率與背景噪聲的熒光率大致匹配。在這個最近的鄰近中，只需要最少數量的熒光光子即可獲得最大的定位精度，因為在圓環零點目標坐標與分子位置之間建立剩余距離需要更少的檢測到的光子。因此，“注入”或對準樣本中的參考坐標將需要大量熒光光子以用于定位的負擔轉移到圓環形的激發光束中無窮無盡的數量的光子上。

由于MINFLUX定位不再受等待大量熒光光子的限制，因此這種納米級精確定位比PALM/STORM中所使用的基于照相機的定位要快得多。使用圓環零點光學地注入坐標的構思也因此固有地存在于原始的STED設計中。對于STED顯微鏡，明顯的是，在沒有背景的情況下，單個檢測到的光子足以證明在圓環零點目標坐標處存在熒光團。在那里，發射熒光團也被STED光束所注入的光子完美地定位。