[發(fā)明專利]一種增加番茄果實重量及心室數(shù)目的基因及其調(diào)控方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110890725.2
• 申請日: 2021-08-04
• 公開（公告）號: CN113462706A
• 公開（公告）日: 2021-10-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張華;胡康棣;姚改芳;孫紅葉;孫忱;彭湘君;趙玉琪;宋慧慧;李立霞
• 申請（專利權(quán)）人: 合肥工業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/60
• 分類號: C12N15/60;C12N15/84;A01H5/08;A01H6/82
• 代理公司: 蘇州翔遠專利代理事務(wù)所(普通合伙) 32251
• 代理人: 王華

1.一種增加番茄果實重量及心室數(shù)目的基因，其特征在于：所述基因的核苷酸序列如Seq No.1所示。

2.一種增加番茄果實重量及心室數(shù)目的基因調(diào)控方法，其特征在于：包括下列步驟：

步驟1：以番茄cDNA為模板，以上游引物-F和下游引物-R進行PCR擴增，PCR擴增產(chǎn)物純化后，得到目的基因片段；

上游引物-F：5’- tacggtacctctagaggatccTAATCCTAAATGGAACCGGC-3’；

下游引物-R：5’- aacatcgtaaggatactcgagTTCTGAGTGAAGCATCTTAC-3’；

步驟2：用限制性內(nèi)切酶BamHI和限制性內(nèi)切酶XhoI對載體pBI121進行雙酶切，酶切產(chǎn)物純化后，得到線性pBI121載體；

步驟3：目的基因片段和線性pBI121載體進行重組，得到LCD1-pBI121質(zhì)粒；

步驟4：將LCD1-pBI121質(zhì)粒轉(zhuǎn)化EHA105農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞；

步驟5：含有LCD1-pBI121質(zhì)粒的EHA105農(nóng)桿菌侵染番茄子葉并獲得轉(zhuǎn)基因陽性苗。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的增加番茄果實重量及心室數(shù)目的基因調(diào)控方法，其特征在于：步驟1中，PCR擴增體系為50 μL：番茄cDNA2μL、上游引物-F和下游引物-R各2μL、5×高保真DNA聚合酶緩沖液10μL、高保真DNA聚合酶1μL、脫氧核糖核苷三磷酸dNTP混合物1μL、雙蒸水補至50 μL。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的增加番茄果實重量及心室數(shù)目的基因調(diào)控方法，其特征在于：步驟1中，PCR擴增參數(shù)為：預(yù)變性94℃，5min；變性94℃，30s；退火50℃，30s；延伸72℃，2min，32個循環(huán)；末次延伸72℃，5 min。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的增加番茄果實重量及心室數(shù)目的基因調(diào)控方法，其特征在于：步驟2中，雙酶切體系為50μL：100ng的載體pBI121100ng、5μL的10×Cutsmart Buffer、限制性內(nèi)切酶BamHI和限制性內(nèi)切酶XhoI各1.5μL、雙蒸水補充至50 μL，冰上混勻后放入37℃水浴反應(yīng)1-2 h。

6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的增加番茄果實重量及心室數(shù)目的基因調(diào)控方法，其特征在于：步驟3中，目的基因片段和線性pBI121載體用一步克隆試劑盒ClonExpressⅡ One StepCloning Kit進行重組，重組條件為：37℃連接30min，結(jié)束后置于冰上保存；取步驟1得到的PCR擴增產(chǎn)物加入到100μL大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，冰上靜置30 min，42℃熱激45s，冰浴2-3min；在離心管中加入700μL的LB液體培養(yǎng)基，置于37℃，150rpm搖床中振蕩培養(yǎng)45min；培養(yǎng)得到的菌液4000rpm離心2min，棄上清200μL，吸取剩余菌液均勻涂布于含有卡那霉素抗性的固體培養(yǎng)基，37℃倒置培養(yǎng)16h；挑取單克隆菌落，于10μL無菌水中吹吸混勻，取2μL菌液進行菌落鑒定。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的增加番茄果實重量及心室數(shù)目的基因調(diào)控方法，其特征在于：進行菌落鑒定時，菌落PCR擴增體系為25μL：2μL菌液、0.5μL上游引物-F、0.5μL下游引物-R、12.5μL的2×DNA聚合酶混合體系、9.5μL雙蒸水，冰上混勻；PCR擴增參數(shù)為：預(yù)變性95℃，3min；變性95℃，15s；退火58℃，15s，延伸72℃，90s，35個循環(huán)；徹底延伸72℃，5min；4℃，60min；待反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，檢測條帶大小是否符合結(jié)果，將條帶位置正確的單克隆擴大培養(yǎng)，即在菌液中加入LB液體培養(yǎng)基5 ml，并加入25μL 的濃度為10mg/mL卡那霉素后混勻，37℃，200 rpm搖床中振蕩培養(yǎng)12-16h，然后提取菌液中的質(zhì)粒，并將提取的質(zhì)粒于-20℃保存。