[發明專利]用于鑒別革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌的數字PCR檢測試劑盒和應用

在審

• 申請號: 202110889429.0
• 申請日: 2021-08-04
• 公開（公告）號: CN113528684A
• 公開（公告）日: 2021-10-22
• 發明（設計）人: 夏江;朱海濤
• 申請（專利權）人: 領航基因科技（杭州）有限公司
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6851;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 陸惠中;王永偉

本發明公開了一種用于鑒別革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌的數字PCR檢測試劑盒和應用，本發明的一種用于鑒別革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌的數字PCR檢測試劑盒，包括F/R引物、探針和標準陽性模板，所述的F/R引物為BAC?F上游引物和BAC?R下游引物；所述的探針為BAC?P探針、G?P探針和G+P探針；本發明保護細菌通用檢測、革蘭氏陰性菌檢測以及革蘭氏陽性菌檢測的引物探針序列。本發明保護擴增子內部區分革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌的檢測方案。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，特別涉及一種用于鑒別革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌的數字PCR檢測試劑盒和應用。

背景技術

革蘭氏陰性菌泛指革蘭氏染色反應呈紅色的細菌。在革蘭氏染色實驗中，首先添加了龍膽紫(crystal violet)，進行初染，然后添加碘液復染。第一步染色完成后，革蘭氏陽性菌和陰性菌均被染為紫色。這時進行洗色(洗色的時間至關重要，是染色的關鍵，大約20～30秒)，只有革蘭氏陰性菌會被洗去顏色變為無色，而陽性菌仍為紫色。再添入另一種復染染料(通常使用番紅(safranin)或品紅(fuchsine))，從而將所有的革蘭氏陰性菌染成紅色或粉色，而陽性菌仍為紫色。通過這種測試我們可以區分這兩種細胞壁結構不同的細菌。

革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌是利用革蘭氏染色法來鑒別的兩大類細菌。大多數化膿性球菌都屬于革蘭氏陽性菌，它們能產生外毒素使人致病，而大多數腸道菌多屬于革蘭氏陰性菌，它們產生內毒素，靠內毒素使人致病。

使用革蘭氏染色時經常發現某些革蘭氏陽性菌會褪色；某些革蘭氏陰性菌會由于菌齡或培養基的不同而染色反應不準確。

目前，缺乏一種檢測靈敏度高的用于鑒別革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌的數字PCR檢測試劑盒和應用。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供了一種檢測靈敏度高的用于鑒別革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌的數字PCR檢測試劑盒和應用。

為了實現上述目的，本發明通過如下技術方案實現：本發明的一種用于鑒別革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌的數字PCR檢測試劑盒，包括F/R引物、探針和標準陽性模板，所述的F/R引物為BAC-F上游引物和BAC-R下游引物；所述的探針為BAC-P探針、G-P探針和G+P探針；

所述的BAC-F上游引物具有SEQ ID No.1的核苷酸序列：GGTCTTAGTGATCCGGTGGTTC

所述的BAC-R下游引物具有SEQ ID No.2的核苷酸序列：CCTACTTCAGCCCCAGGATG

所述的BAC-P探針具有SEQ ID No.3的核苷酸序列：ATGGAAGGGCCATCGCTCAACG

所述的G-P探針具有SEQ ID No.4的核苷酸序列：ATCGACGGGGAGGTTTGGCACC

所述的G+P探針具有SEQ ID No.5的核苷酸序列：ATCGACGGCGGTGTTTGGCAC

本發明所述的用于鑒別革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌的數字PCR檢測試劑盒在檢測中的應用。

本發明具有如下優點：本發明保護細菌通用檢測、革蘭氏陰性菌檢測以及革蘭氏陽性菌檢測的引物探針序列。本發明保護擴增子內部區分革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌的檢測方案。

附圖說明

圖1為本發明的技術原理圖；F/R：細菌通用上下游引物，FAM探針：細菌通用探針；CY5探針：革蘭氏陰性菌通用探針；ROX探針：革蘭氏陽性菌通用探針。

圖2為本發明的革蘭氏陰性菌FAM通道和ROX通道散點示意圖；

圖3為本發明的革蘭氏陰性菌FAM通道和CY5通道散點示意圖；