[發明專利]一種高分辨質譜篩選牦牛膠原蛋白特征片段的方法

在審

• 申請號: 202110884038.X
• 申請日: 2021-08-01
• 公開（公告）號: CN113501861A
• 公開（公告）日: 2021-10-15
• 發明（設計）人: 黃彪;雷紹南
• 申請（專利權）人: 青海瑞肽生物科技有限公司
• 主分類號: C07K7/06
• 分類號: C07K7/06;C07K7/08;C07K14/78;C12P21/06;G01N33/68
• 代理公司: 長沙新裕知識產權代理有限公司 43210
• 代理人: 吳越

本發明公開了一種高分辨質譜篩選牦牛膠原蛋白特征片段的方法，其特征在于包括如下步驟：(1)樣本采集；(2)預處理；(3)酶解；(4)高效液相色譜分離：將酶解液采用納升流速的高效液相色譜系統EasynLC進行分離；(5)質譜鑒定：酶解液經色譜分離后用Q?Exactive質譜儀進行質譜鑒定；(6)特征片段篩選：質譜鑒定結果的原始文件用Mascot2.2軟件檢索UniProt蛋白數據庫，篩選得到耗牛膠原蛋白的特征片段。本發明通過高效液相色譜?串聯質譜技術對酶解的牦牛膠原蛋白進行分離鑒定，數據經Mascot2.2軟件與UniProt蛋白數據庫對比分析，篩選出實際樣品中能檢測到的牦牛膠原蛋白特征片段。鑒定的特征片段可用于檢測牦牛源膠原蛋白的真實性與可靠性，為牦牛膠原蛋白成分監管方面提供有效技術支撐。

技術領域

本發明涉及一種牦牛膠原蛋白特征片段的篩選方法，具體涉及一種高分辨質譜篩選牦牛膠原蛋白特征片段的方法。

背景技術

膠原蛋白是廣泛分布于動物組織中的一類白色、不透明、無支鏈的纖維型三螺旋結構蛋白，其降解產物膠原蛋白肽具有促進組織生長、修復損傷、保濕鎖水、減輕色素等多種功效，且沒有過敏蛋白質,能夠被機體完全吸收，以廣泛應用在功能食品、保健飲料、化妝品和醫藥等各方面。

近年來對于牦牛牛皮、牛骨等副產物的精細加工逐漸興起，而膠原蛋白的制備是其中主要加工模式，造成市場上出現了明目繁多的牦牛膠原蛋白肽和牦牛膠原骨肽產品，對于其中成分是否來源于商品名中所標識的牦牛源性,以及其中是否含有牦牛膠原蛋白方面還缺乏有效的監督監管,且目前國內無相關檢測方法報道。基于高通量和高分辨率質譜技術，結合蛋白質數據庫分析不同物種蛋白質的方法簡單、準確、可靠，近年來已成為蛋白質鑒定的主要方法。由于不同物種膠原蛋白的氨基酸序列存在差異，通過序列差異鑒別膠原蛋白是一種潛在的追溯其物種來源的方法。

發明內容

針對上述問題，本發明的目的在于提供一種高分辨質譜鑒定牦牛膠原蛋白特征片段的方法及其應用。本發明通過高效液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS)技術對酶解的牦牛膠原蛋白進行分離鑒定，數據經Mascot2.2軟件與UniProt蛋白數據庫對比分析，篩選出實際樣品中能檢測到的牦牛膠原蛋白特征片段。鑒定的特征片段可用于檢測牦牛源膠原蛋白的真實性與可靠性，為牦牛膠原蛋白成分監管方面提供有效技術支撐。

本發明通過下述技術方案實現。

一種高分辨質譜篩選牦牛膠原蛋白特征片段的方法，其特征在于包括如下步驟：

(1)樣本采集

收集耗牛副產物作為樣本，之后將其分割成小塊，于低溫保存，備用；

(2)預處理

將牦牛副產物進行脫脂和除雜處理，之后用純水清洗干凈，備用；

(3)酶解

將預處理后的耗牛副產物放置于80～90℃熱水中保溫預變性處理2～4h，之后冷卻至45～50℃，調節pH 8～9，加入堿性蛋白酶與絲氨酸蛋白酶的復合酶液酶解4～6h，高溫滅酶活后獲得酶解液；

(4)高效液相色譜分離

將酶解液采用納升流速的高效液相色譜系統EasynLC進行分離；

(5)質譜鑒定

酶解液經色譜分離后用Q-Exactive質譜儀進行質譜鑒定；

(6)特征片段篩選

質譜鑒定結果的原始文件用Mascot2.2軟件檢索UniProt蛋白數據庫，篩選得到耗牛膠原蛋白的特征片段。