[發(fā)明專利]分泌抗非洲豬瘟病毒E165R蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞株、抗體、抗原表位肽及應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110880084.2
• 申請日: 2021-08-02
• 公開（公告）號: CN113717945B
• 公開（公告）日: 2023-08-11
• 發(fā)明（設計）人: 莊國慶;孫愛軍;張帥;張改平
• 申請（專利權）人: 河南農業(yè)大學
• 主分類號: C12N5/20
• 分類號: C12N5/20;C07K16/08;C07K14/005;A61K39/42;A61K39/12;A61P31/20;G01N33/577;G01N33/569
• 代理公司: 濟南魯科專利代理有限公司 37214
• 代理人: 滕慧

本發(fā)明公開了一株分泌抗非洲豬瘟病毒E165R蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞株，分類命名為：ASFV?E165R?8F9，保藏單位：中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號：CCTCC?NO:C2021181，保藏日期：2021年7月15日。本發(fā)明還公開了該雜交瘤細胞株分泌的單克隆抗體、該單克隆抗體在制備檢測非洲豬瘟病毒的試劑、試劑盒、生物芯片中的應用、在制備預防或治療非洲豬瘟病毒的藥物中的應用。本發(fā)明還提供了該單克隆抗體識別的抗原表位在制備預防或治療非洲豬瘟病毒的藥物中的應用。本發(fā)明的單克隆抗體，能夠顯著抑制E165R的酶活性，具備開發(fā)為ASFV治療性抗體藥物的應用潛力。

技術領域

本發(fā)明涉及分子病毒學和免疫技術領域，尤其涉及一種分泌抗非洲豬瘟病毒E165R蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞株、抗體、抗原表位肽及應用。

背景技術

非洲豬瘟病毒(African?swine?fever?virus，ASFV)屬于非洲豬瘟病毒科、非洲豬瘟病毒屬的唯一成員，能夠感染家豬、野豬，引起急性、出血性的烈性傳染病病原，感染致死率高達100％，是我國動物疫病防控中重點監(jiān)控的Ⅰ類動物疫病，目前尚無安全有效的疫苗用于ASFV的防控。

ASFV是雙鏈DNA病毒，基因組長170-193Kb，病毒顆粒直徑為260-300nm，編碼超過150種蛋白。ASFV結構復雜，具有外膜、外衣殼、內膜、內衣殼、核殼五層囊膜結構。復制過程中會編碼多種核酸復制相關酶類，用于保證復制的保真性。

E165R蛋白是ASFV編碼的一種dUTPase酶(脫氧尿苷焦磷酸酶)，用于控制DNA復制過程中dUT/dTT的比例，降低DNA復制過程中的錯誤堿基的引入。前期的研究表明，缺失E165R基因會導致ASFV在細胞上的復制水平下降；晶體結構解析顯示E165R是一種三聚體結構，屬于Ⅰ型dUTPase酶。E165R蛋白是ASFV藥物、疫苗研究的重要靶點之一，制備針對E165R的單克隆抗體藥物是ASFV相關藥物研發(fā)的重要的方向之一。

發(fā)明內容

本發(fā)明提供了一種分泌抗非洲豬瘟病毒E165R蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞株、抗體及應用,并鑒定了該抗體識別的表位肽信息，提供了抗原表位肽及應用，解決了現(xiàn)有技術中存在的問題。

為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術方案是：

一種分泌抗非洲豬瘟病毒E165R蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞株，分類命名為：ASFV-E165R-8F9，保藏單位：中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號：CCTCC?NO:C2021181，保藏日期：2021年7月15日，保藏地址：中國.武漢.武漢大學。

上述抗非洲豬瘟病毒E165R單抗的雜交瘤細胞株的制備方法如下：

利用大腸桿菌表達系統(tǒng)制備具有6個組氨酸(His)標簽的重組E165R蛋白，經(jīng)過親和層析和分子篩純化后免疫小鼠，制備雜交瘤單克隆細胞株。

一種抗非洲豬瘟病毒E165R蛋白的單克隆抗體，通過培養(yǎng)上述雜交瘤細胞株獲得，命名為ASFV-E165R-8F9。通過蛋白重疊表達和合成重疊的多肽，利用蛋白免疫印跡(Western?blotting)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme?linked?immunosorbent?assay，ELISA)檢測抗體識別的具體表位肽信息為?149-RGEGRFGSTG-158，對抗體進行亞型分類顯示該抗體為IgG2A。

進一步地，培養(yǎng)上述雜交瘤單克隆細胞株獲得單克隆抗體，經(jīng)過重組E165R?蛋白的Western?blotting和真核瞬時轉染后間接免疫熒光(Indirect?immunofluorescentassay，IFA)鑒定后，獲得能夠識別E165R重組蛋白的單克隆抗體，命名為ASFV-E165R-8F9單克隆抗體。