[發明專利]實時熒光定量PCR檢測試劑盒、判斷檳榔幼苗缺鋅狀態的方法

在審

• 申請號: 202110878832.3
• 申請日: 2021-08-02
• 公開（公告）號: CN113403419A
• 公開（公告）日: 2021-09-17
• 發明（設計）人: 萬迎朗;崔闖
• 申請（專利權）人: 海南大學
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6851
• 代理公司: 成都天匯致遠知識產權代理事務所(普通合伙) 51264
• 代理人: 韓曉銀

1.一種ZIP基因的實時熒光定量PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述ZIP基因的實時熒光定量PCR檢測試劑盒，包括一組AcZIP表達水平檢測引物和一對檳榔內參基因。

2.如權利要求1的，ZIP基因的實時熒光定量PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述引物ZIP1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述引物ZIP2核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述內參引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；所述引物對中的兩條單鏈DNA既可分貝單獨包裝，也可等摩爾混合包裝。

3.一種如權利要求1所述ZIP基因的實時熒光定量PCR檢測試劑盒在檢測檳榔是缺鐵還是缺鋅中的應用，其特征在于，所述ZIP基因的實時熒光定量PCR檢測試劑盒在檢測檳榔是缺鐵還是缺鋅中的應用方法，包括：

提取待測樣品的基因組RNA，逆轉錄為cDNA為模板，使用試劑盒中的ZIP基因檢測引物與內參引物進行RT-qPCR反應，以正常樣品為對照，按照2^(-ΔΔCt)計算相對豐度，得到基因的相對表達量；

根據AcZIP家族的相對表達量，若ZIP1在新葉中表達量沒有顯著變化，在根中表達量顯著增加，ZIP2在新葉中表達量顯著上調，在根中沒有顯著變化，說明植株受到缺鋅脅迫。

4.一種通過AcZIP家族基因差異性表達判斷檳榔幼苗缺鋅狀態的方法，其特征在于，所述通過AcZIP家族基因差異性表達判斷檳榔幼苗缺鋅狀態的方法包括以下步驟：

步驟一，實驗基地進行檳榔缺鋅的處理；

步驟二，進行樣品的采集；

步驟三，進行ZIP家族分析；

步驟四，進行引物設計；

步驟五，進行引物的特異性驗證；

步驟六，進行實時熒光定量PCR檢測。

5.如權利要求4所述通過AcZIP家族基因差異性表達判斷檳榔幼苗缺鋅狀態的方法，其特征在于，步驟一中，所述實驗基地進行檳榔缺鋅的處理，包括：

在實驗基地以Hoagland為配方，采用水培的方法對一葉期進行適應性培養后的檳榔幼苗進行缺鐵和缺鋅的處理，每隔一周時間進行培養液的更換，直到檳榔幼苗出現明顯的表型；其中，缺鋅的檳榔幼苗的新葉呈網格狀的黃化現象。

6.如權利要求4所述通過AcZIP家族基因差異性表達判斷檳榔幼苗缺鋅狀態的方法，其特征在于，步驟二中，所述樣品的采集，包括：

對出現黃化現象的檳榔幼苗的葉片以及主根進行收集，用75%的乙醇擦拭干凈，用液氮凍干，用天根多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取樣品的RNA，cDNA合成根據反轉錄試劑盒操作進行，-20℃凍存。

7.如權利要求4所述通過AcZIP家族基因差異性表達判斷檳榔幼苗缺鋅狀態的方法，其特征在于，步驟三中，所述ZIP家族分析，包括：

ZIP家族PF02535在植物鐵和鋅的轉運中起到重要作用；選取在轉錄組中差異表達的兩組ZIP基因來區分缺鋅，四組ZIP基因簡單命名為ZIP1和ZIP2。

8.如權利要求4所述通過AcZIP家族基因差異性表達判斷檳榔幼苗缺鋅狀態的方法，其特征在于，步驟五中，所述引物的特異性驗證，包括：

以提取的正常樣品的cDNA為模板，進行PCR擴增，擴增的目的條帶的大小分別為267bp和291bp；回收PCR產物，連接T載，進行測序，與ZIP1和ZIP2的核酸序列進行比較，以檢測該引物的特異性；其中，所述ZIP1的核酸序列如SEQ ID NO：4所示，所述ZIP2的核酸序列如SEQID NO：5所示；

其中，所述PCR反應體系，包括：

總反應體系：25μL；2*Vazyme LAMP Master Mix：12.5μL；ZIP-F：1μL；ZIP-R：1μL；cDNA：1μL；ddH₂O：9.5μL；

所述PCR反應程序：94℃預變性4min；94℃變性30s，54℃退火30s，72℃延伸45s，共35個循環；72℃補充延伸10min；PCR擴增產物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳檢測。