[發明專利]一種表達小鼠p53a或p53b蛋白質粒及其構建方法和應用

在審

• 申請號: 202110876739.9
• 申請日: 2021-07-31
• 公開（公告）號: CN113584081A
• 公開（公告）日: 2021-11-02
• 發明（設計）人: 劉曉明;陳放;霍立軍;程靜;張帆;朱春芳;趙軍招
• 申請（專利權）人: 溫州醫科大學附屬第二醫院(溫州醫科大學附屬育英兒童醫院)
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/66;C12N15/12;C12N15/10;C12N5/10;C12N5/071
• 代理公司: 北京酷愛智慧知識產權代理有限公司 11514
• 代理人: 胡林

1.一種表達小鼠p53a或p53b蛋白質粒的構建方法，其特征在于，包括如下步驟：

(a)提取小鼠組織中的RNA，并反轉錄為cDNA；

(b)以cDNA為模板對表達p53a和p53b蛋白的基因分別進行PCR擴增，其中，表達P53a蛋白基因的上游引物序列如SEQ ID NO:1所示，下游引物序列如SEQ ID NO:2所示；表達P53b蛋白基因的上游引物序列如SEQ ID NO:3所示，下游引物序列如SEQ ID NO:4所示；

(c)將表達p53a蛋白的基因片段、表達p53b蛋白的基因片段以及pCMV-HA經BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切后，回收酶切產物，再將酶切后的表達p53a蛋白的基因片段和表達p53b蛋白的基因片段分別連接到pCMV-HA上、轉化大腸桿菌，提取重組質粒；

(d)酶切鑒定和測序正確的重組質粒進行轉染擴增，提取質粒，即得表達小鼠p53a蛋白的質粒和表達p53b蛋白的質粒。

2.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于，所述小鼠組織為小鼠肝臟。

3.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于，所述步驟(b)中，表達p53a蛋白基因的擴增條件如下：

95℃5min，一個循環；95℃30s，65.5℃45s，72℃2min，35個循環；72℃延伸10min；16℃10min；

表達p53b蛋白基因的擴增條件如下：

95℃5min，一個循環；95℃30s，70.1℃45s，72℃1min50s，35個循環；72℃延伸10min；16℃10min。

4.一種表達小鼠p53a或p53b蛋白質粒，其特征在于，通過權利要求1～3任一所述構建方法構建得到。

5.一種宿主細胞，其特征在于，所述宿主細胞被權利要求4所述的質粒所轉化。

6.根據權利要求5所述的宿主細胞，其特征在于，所述宿主細胞為小鼠顆粒細胞。

7.根據權利要求6所述的宿主細胞，其特征在于，所述宿主細胞通過如下方法制得：

(a)在3周齡的SPF級小鼠體內注射8～10IU PMSG，48h后殺死小鼠，取卵巢，再經分離得到小鼠排卵前期顆粒細胞；

(b)將小鼠排卵前期顆粒細胞接種于含有10％胎牛血清和1％雙抗的DMEM/F12培養液的6孔板中，待長至細胞匯合度為80％時，更換成無雙抗的DMEM/F12培養液，12h后，按照lipofectamine LTX中的轉染方法采用權利要求4所述的質粒轉染細胞，即得所述宿主細胞。

8.根據權利要求7所述的宿主細胞，其特征在于，所述質粒的轉染量為2μg；轉染時間為24h。