[發明專利]一種發酵生產L-苯丙氨酸的方法

在審

• 申請號: 202110873708.8
• 申請日: 2021-07-30
• 公開（公告）號: CN113801901A
• 公開（公告）日: 2021-12-17
• 發明（設計）人: 岳明瑞;謝沛;曹華杰;郭永勝
• 申請（專利權）人: 新泰市佳禾生物科技有限公司;汕頭市佳禾生物科技有限公司
• 主分類號: C12P13/22
• 分類號: C12P13/22;C12N1/21;C12N15/53;C12N15/54;C12N15/60;C12N15/61;C12N15/70;C12R1/19
• 代理公司: 濟南譽豐專利代理事務所(普通合伙企業) 37240
• 代理人: 薛鵬喜

1.一種發酵生產L-苯丙氨酸的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)將L-苯丙氨酸生產菌的種子液接種至發酵培養基中進行發酵培養，初始發酵溫度為35-37℃，攪拌轉速為200-400rpm，風量30-50L/min，罐壓0.05-0.1MPa，發酵過程中控制溶氧為15-35％；

發酵培養4-6h后，加入IPTG進行誘導培養，誘導培養的溫度為35-37℃，控制溶氧為30-40％，誘導培養40-42h；

培養過程中監測體系的殘糖含量，當體系的殘糖含量≤0.5g/L時開始補糖，通過流加葡糖糖溶液使體系中的葡萄糖濃度保持在0.5-1g/L；

(2)將誘導培養后的培養物進行破菌處理，即生產得到含有L-苯丙氨酸的培養液。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)中，所述L-苯丙氨酸生產菌由如下方法構建而成：

將質粒pET-28a(+)用NcoⅠ和SacⅠ雙酶切處理，將aroB基因整合到雙酶切處理后的質粒pET-28a(+)上，得到重組質粒pET-aroB，再用EagⅠ和XhoⅠ對重組質粒pET-aroB進行酶切處理，將aroE基因整合到酶切處理后的重組質粒pET-aroB上，獲得第一重組表達載體；

將質粒pGEX-2T用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切處理，將aroF基因整合到雙酶切處理后的質粒pGEX-2T上，得到重組質粒pGEX-2T-aroF，再用TthlllⅠ和AatⅡ對重組質粒pGEX-2T-aroF進行酶切處理，pheA基因整合到酶切處理后的重組質粒pGEX-2T-aroF上，獲得第二重組表達載體；

將獲得的第一重組表達載體和第二重組表達載體導入到同一大腸桿菌酪氨酸營養缺陷型菌株中，構建得到L-苯丙氨酸生產菌；

所述aroB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述aroE基因的核苷酸序列如SEQID NO.2所示；所述aroF基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述pheA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)中，所述發酵培養基的組成為：葡萄糖30g/L、酵母粉6g/L、蛋白胨2g/L、玉米漿10g/L、磷酸氫二鉀3g/L、硫酸銨2g/L、檸檬酸2g/L、硫酸鎂1g/L、FeSO₄·7H₂O 0.1g/L、MnSO₄·H₂O 9mg/L、硫酸鋅12.8mg/L、Co(NO₃)₂·6H₂O 9.8mg/L、CuSO₄·5H₂O 1.2mg/L、維生素B1 0.3mg/L、維生素H 0.3mg/L。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)中，加入IPTG，使IPTG在體系中的終濃度為0.5mmol/L。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，采用均質機進行破菌處理，均質處理的條件為：均質壓力15,000PSI，均質流量400L/Hr。