[發明專利]一種柑橘屬中藥的在線活性篩選方法

在審

• 申請號: 202110863477.2
• 申請日: 2021-07-29
• 公開（公告）號: CN113720892A
• 公開（公告）日: 2021-11-30
• 發明（設計）人: 曹君;閆天賜;樂紫璇;顧郁欣
• 申請（專利權）人: 杭州師范大學
• 主分類號: G01N27/447
• 分類號: G01N27/447;G01N30/06;G01N30/88
• 代理公司: 杭州杭誠專利事務所有限公司 33109
• 代理人: 何俊

本發明涉及酶抑制劑篩選領域，針對傳統的酶抑制劑篩選方法效率低的問題，提供一種柑橘屬中藥的在線活性篩選方法，采用電泳介導的微量分析法EMMA，在毛細管中用脂肪酶催化水解底物的一步反應，然后在紫外400nm處直接測定產物峰面積實現脂肪酶抑制劑的在線篩選，最后利用分子對接技術對脂肪酶抑制劑的篩選結果進行驗證。本發明將酶抑制劑的篩選與毛細管電泳相結合，不僅實現了脂肪酶抑制劑的在線篩選，也極大地提高了酶抑制劑篩選的效率，與傳統的酶抑制劑篩選方法相比，本方法具有更短的分析時間、更高的分離效率、更少的試劑消耗。

技術領域

本發明涉及酶抑制劑篩選領域，尤其是涉及一種柑橘屬中藥的在線活性篩選方法。

背景技術

肥胖已被世界衛生組織(WHO)視為人類最大的流行病，它是導致一系列病理狀況的重要危險因素，如高血壓、腎臟疾病、糖尿病、高脂血癥、冠心病、精神障礙和某些癌癥。研究表明，肥胖是由脂肪過度或異常積累引起的。甘油三酯是體內含量最豐富的脂肪類型，主要儲存在脂肪組織中。脂肪酶，也稱為三酰甘油酰基水解酶，是一類酯酶，在甘油三酯的完全消化中起關鍵作用，能夠將50％至70％的膳食脂肪水解為甘油和脂肪酸。因此，抑制脂肪酶的活性可以有效抑制脂肪的水解和吸收，從而達到減肥的效果。抑制脂肪酶活性是對抗肥胖及其相關疾病的熱門話題。奧利司他是唯一被批準用于長期體重管理的脂肪酶抑制劑。然而，它經常表現出強烈的胃腸道副作用，例如脹氣、惡心、腹瀉和嘔吐。因此，尋找安全、有效、新型的脂肪酶抑制劑來治療肥胖癥是非常緊迫和必要的。

天然產物因含有豐富的生物活性化合物而備受關注。柑橘屬果實是世界各國的主要食用果實，也是我國的傳統藥用植物。它是黃酮類最重要的膳食來源之一。柑橘屬黃酮，含有多個酚羥基，例如橙皮苷和柚皮苷等苷類。相關研究表明，柑橘類黃酮具有許多生物活性，例如抗氧化、抗病毒、抗炎、抗癌和抗動脈粥樣硬化等。研究表明，柑橘屬黃酮通過直接或間接介導AMPK、PPAR和NF-κB信號通路來調節抗氧化的指標進而治療肥胖，但其對脂肪酶活性的影響鮮有報道。因此，本實驗選擇從柑橘屬黃酮類化合物中進行脂肪酶抑制劑的篩選。

傳統的酶分析方法是將酶和底物離線孵育，然后用分光光度計或酶標儀測定結果。但是該方法自動化程度低、時間長、樣品消耗大，不適合酶抑制劑的高通量篩選。近年來，一些新的酶學分析方法，如超濾、中空纖維固定和磁性納米顆粒固定，已被用于酶抑制劑篩選實驗。然而，這些方法也只能用于離線分析。如今，毛細管電泳(CE)作為一種在線酶分析工具已經引起了廣泛的關注。研究表明，CE因分析時間短、易于自動化、分離效率高、試劑消耗少等優點，被廣泛應用于酶抑制劑的篩選和酶動力學參數的測定。電泳介導的微量分析(EMMA)是CE中廣泛使用的一種模式。在EMMA中，毛細管用作微反應器，其中反應物可以連續注入同一毛細管中進行酶促反應、分離和檢測。Lilin Tang等人使用EMMA方法篩選中藥中的酪氨酸酶抑制劑。Jing Han等人通過EMMA法從12種中藥提取物中篩選出一種具有組織蛋白酶B抑制活性的中藥。Hairong Wang等人開發了一種用于篩選氨肽酶N抑制劑的EMMA方法(王海榮.2015.氨肽酶N抑制劑毛細管電泳在線篩選方法的研究.Doctoraldissertation,山東大學.)。然而，由于脂肪酶底物難以溶解并且溶解后穩定性差，目前鮮有報道用EMMA方法篩選脂肪酶抑制劑。

發明內容

本發明為了克服傳統的酶抑制劑篩選方法效率低的問題，提供一種柑橘屬中藥的在線活性篩選方法，將酶抑制劑的篩選與毛細管電泳相結合，不僅實現了脂肪酶抑制劑的在線篩選，也極大地提高了酶抑制劑篩選的效率。與傳統的酶抑制劑篩選方法相比，本方法具有更短的分析時間、更高的分離效率、更少的試劑消耗。

為了實現上述目的，本發明采用以下技術方案：

一種柑橘屬中藥的在線活性篩選方法，采用電泳介導的微量分析法EMMA，在毛細管中用脂肪酶催化水解底物的一步反應，然后在紫外400nm處直接測定產物峰面積實現脂肪酶抑制劑的在線篩選，最后利用分子對接技術對脂肪酶抑制劑的篩選結果進行驗證；

所述電泳介導的微量分析法包括以下步驟：