[發(fā)明專利]一種雞松果體細(xì)胞的分離及原代培養(yǎng)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110863431.0
• 申請(qǐng)日: 2021-07-29
• 公開（公告）號(hào): CN113444681B
• 公開（公告）日: 2022-07-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳繼蘭;孫研研;王攀林;李云雷;麻慧;袁經(jīng)緯
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所
• 主分類號(hào): C12N5/071
• 分類號(hào): C12N5/071
• 代理公司: 蘇州言思嘉信專利代理事務(wù)所(普通合伙) 32385
• 代理人: 劉巍

本發(fā)明提供了一種原代雞松果體細(xì)胞分離及原代培養(yǎng)方法，包含以下步驟：取胚胎期雞松果體組織，清洗后，將松果體組織剪碎，在0.25％胰蛋白酶中消化15分鐘，終止消化后收集細(xì)胞沉淀，之后加入細(xì)胞接種液并過(guò)200目網(wǎng)篩，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6～8h后，取出更換細(xì)胞培養(yǎng)液后置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，獲得的細(xì)胞純度高，細(xì)胞形態(tài)好。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明設(shè)計(jì)雞松果體細(xì)胞離體培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，特別設(shè)計(jì)一種雞松果體細(xì)胞分離及原代培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)

禽類松果體位于大腦兩半球和小腦之間的三角形間隙內(nèi)，頂部與硬腦膜相連接，尖部向下延續(xù)為長(zhǎng)的細(xì)柄與第三腦室相連。松果體是禽類重要的光內(nèi)分泌器官，被認(rèn)為是生物節(jié)律研究的模型，其整合光信息通過(guò)分泌褪黑激素調(diào)控機(jī)體。眾所周知，褪黑激素可以改善睡眠質(zhì)量，參與抗氧化系統(tǒng)，防止細(xì)胞產(chǎn)生氧化損傷，控制機(jī)體內(nèi)各種內(nèi)分泌腺的活動(dòng)，進(jìn)而控制動(dòng)物全身的機(jī)能。目前禽類松果體功能相關(guān)研究較少，松果體細(xì)胞體外培養(yǎng)可以去除體液因素以及外來(lái)神經(jīng)對(duì)松果體的作用，可作為研究其自身分泌功能、特性以及合成的重要方法。禽類松果體原代細(xì)胞分離及培養(yǎng)，建立原代細(xì)胞培養(yǎng)方法，為研究禽類松果體的功能積累材料。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種雞原代松果體細(xì)胞分離與培養(yǎng)的新方法，以彌補(bǔ)雞原代松果體細(xì)胞分離與培養(yǎng)方法的空白，為雞松果體功能的研究提供工具細(xì)胞。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了一種雞原代松果體細(xì)胞分離與培養(yǎng)的新方法，具體內(nèi)容如下：

一方面，本發(fā)明提供了一種雞原代松果體細(xì)胞分離方法，包括以下步驟：

無(wú)菌條件下取出雞胚松果體組織，放入提前預(yù)冷含有1％三抗的PBS中；

用含有1％三抗的PBS清洗組織3次，利用顯微手術(shù)鑷去除周圍的血管和外膜。

將組織轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管底部，加入少量1％三抗的PBS，以覆蓋組織為宜。

將組織剪碎后，靜置5分鐘后，組織塊沉降之后，棄去上層PBS。組織塊轉(zhuǎn)移至15ml離心管，加入0.25％胰蛋白酶，37℃水浴消化15分鐘。

加入提前預(yù)熱的完全培養(yǎng)基終止消化，1000r/min，離心5分鐘收集細(xì)胞沉淀。

加入5ml細(xì)胞接種液重懸細(xì)胞沉淀，經(jīng)200目細(xì)胞網(wǎng)篩過(guò)濾未消化好的大組織塊，收集細(xì)胞懸液；

采用血球計(jì)數(shù)板細(xì)胞計(jì)數(shù)，添加細(xì)胞接種液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10⁶/mL；

細(xì)胞輕輕吹打混勻后，接種至6孔板中，置于39℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6～8h，更換為細(xì)胞培養(yǎng)液，繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)兩天后松果體細(xì)胞狀態(tài)具有神經(jīng)樣細(xì)胞形態(tài)，可用于細(xì)胞試驗(yàn)。

在以上技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，優(yōu)選的完全培養(yǎng)基為89％DMEM培養(yǎng)基，10％胎牛血清(FBS)和1％三抗；

在以上技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，優(yōu)選的細(xì)胞接種液為78％DMEM，20％FBS，1％三抗，1％L-谷氨酰胺；

在以上技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，優(yōu)選的細(xì)胞培養(yǎng)液為95.999％Neurolbasal培養(yǎng)基，2％的B27、1％三抗，1％L-谷氨酰胺，0.001％阿糖胞苷；

在以上技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，優(yōu)選的細(xì)胞培養(yǎng)箱的溫度為39℃。

相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明彌補(bǔ)了原代雞松果體細(xì)胞分離和培養(yǎng)方法的空白。

本發(fā)明采用胚胎期松果體進(jìn)行原代松果體細(xì)胞分離培養(yǎng)具有一定的優(yōu)勢(shì)：①試驗(yàn)材料成本低，容易獲得；②胚胎期雞胚的頭蓋骨沒(méi)有鈣化，質(zhì)地較軟，便于在較短時(shí)間內(nèi)完成采樣；③胚胎期松果體較成年動(dòng)物的增殖能力強(qiáng)。