[發明專利]一種由農桿菌介導的草莓‘甜查理’遺傳轉化體系的構建方法

在審

• 申請號: 202110863219.4
• 申請日: 2021-07-29
• 公開（公告）號: CN113755521A
• 公開（公告）日: 2021-12-07
• 發明（設計）人: 鄒小花;黃系倫;劉海婷;劉雅;高清華
• 申請（專利權）人: 上海市農業科學院
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;A01H4/00;A01H5/00;A01H6/74
• 代理公司: 南京華恒專利代理事務所(普通合伙) 32335
• 代理人: 裴素艷

1.一種由農桿菌介導的草莓甜查理遺傳轉化體系的構建方法，其特征在于，包括如下步驟：

（1）采用莖尖組培快繁技術得到草莓‘甜查理’無菌苗；

（2）利用步驟（1）制備的無菌苗進行葉片再生愈傷誘導和不定芽誘導；

（3）活化農桿菌，用農桿菌浸染草莓‘甜查理’葉片和葉柄，并進行共培養，然后進行農桿菌控菌殺菌處理；

（4）用抗生素梯度篩選陽性愈傷和不定芽，然后在增值培養基中培養擴增，將擴增得到的三葉一心的單獨苗轉移到優選生根培養基中進行生根培養；

（5）采用轉化JH19載體上的通用載體序列片段Cas9 基因序列片段設計引物進行PCR擴增檢測或熒光蛋白eGFP發光情況觀察進行陽性轉化株系檢測。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（1）中，首先對匍匐莖消毒處理，然后依次進行莖尖誘導培養、增殖培養和生根培養，其中，莖尖誘導的培養基為M1：MS +GA 0.3-0.5mg/L+ 6-BA 0.3-0.5 mg/L；增殖培養基為M3：MS +IBA 0.01-0.02 mg/L+ 6-BA 0.2-0.4 mg/L ；生根培養基M5為MS +IBA 0.03-0.05 mg/L。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（2）中，先將‘甜查理’無菌苗葉片用滅菌的手術刀將葉片邊緣鋸齒切開，然后將葉片沿著葉脈切成1立方厘米大小的葉塊進行愈傷預培養和不定芽誘導，誘導培養基為M7：MS +IBA 0.1 mg/L+TDZ 1.8- 2.6mg/L。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，農桿菌首先在固體LB培養基活化，然后在液體LB培養基上先后經過兩次量搖后，檢測OD600=1-2范圍之間備用。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述農桿菌菌株為GV3101，遺傳轉化的載體是Getway系統載體JH19。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，農桿菌與草莓葉片和葉柄在M9：MS+乙酰丁香酮（AS）20 mg/L的浸染液中侵染15-30 min，轉移到無菌濾紙上吸干多余菌液，得到染了農桿菌的預培養葉片，然后將其轉接到培養基M10：MS+ IBA 0.1mg/L + TDZ 2.4 mg/L +AS 20 mg/L 上進行暗共培養2-3天，以肉眼可見培養基上有農桿菌長出為最佳停止培養時間。

7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，殺菌處理的方法為，將農桿菌共培養后獲得的葉片在殺菌液M11：MS + Carb 300-400 mg/L + Tim 300-400 mg/L中殺菌處理30-40分鐘，然后轉至殺菌培養基M12：MS+IBA 0.1 mg/L+TDZ 2.4mg/L+Carb250 mg/L+Tim 250mg/L、pH為5.8上進行暗培養10 天。

8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，通過抗生素潮霉素對陽性不定芽的篩選，方法為：殺菌處理后的葉片轉接到篩選培養基：M13：MS+IBA 0.1 mg/L+TDZ 2.4 mg/L+Carb250 mg/L+Cef 50 mg/L+Hyg 1 mg/L上進行篩選，每兩周換一次培養基，每次將潮霉素（Hyg）的濃度提高1 mg/L，直至潮霉素的濃度上調到6 mg/L為上線，且有不定芽長出為止，同時殺菌抗生素Carb和 Cerf的濃度逐步降低到30-50 mg/L，直至沒有農桿菌再生長時不再使用，經過高濃度潮霉素篩選的不定芽，在增殖培養基M4：MS+IBA 0.01 mg/L+ 6-BA 0.3mg/L上培養并擴增，然后將擴增三葉一心的單獨苗轉移至生根培養基M5：MS +IBA 0.03-0.05 mg/L上進行培養。