[發明專利]用于檢測犬糞便中冠狀病毒的通用引物及試劑盒

在審

• 申請號: 202110856628.1
• 申請日: 2021-07-28
• 公開（公告）號: CN113718056A
• 公開（公告）日: 2021-11-30
• 發明（設計）人: 邱泓銓;黃翠琴;包銀莉;鄭燦陽;許洵凱;劉子怡
• 申請（專利權）人: 龍巖學院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6848;C12N15/11
• 代理公司: 福州君誠知識產權代理有限公司 35211
• 代理人: 戴雨君

本發明公開了一種用于檢測犬糞便中冠狀病毒的通用引物及試劑盒。所述引物序列如下：CCoV?MF:5’?GCAACAGGATGGGCTTAC?3’，CCoV?7aR:5’?GCATGGAGGAAAACGAGC?3’。本發明設計的引物可以增加偵測到犬冠狀病毒陽性的比例，也可以減少不必要的測序時間的浪費,對于快速篩檢有很大的幫助。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及用于檢測犬糞便中冠狀病毒的通用引物及試劑盒。

背景技術

CCoV(canine coronavirus)屬于α冠狀病毒，引起犬傳染性腸炎，導致犬輕重不一的腹瀉，是對犬危害較大的一種病原體。所有年齡的犬都可感染CCoV，但是幼犬更易感染并且發生臨床癥狀。在一個較大范圍的調查中，正常犬CCoV的陽性率達45％，腹瀉犬陽性率達61％，在對患胃腸炎的寵物犬的糞便檢測中，發現19.5％為CCoV陽性。日本腹瀉犬曾分離到8個CCoV毒株，試驗證明這些毒株在抗原性方面有很大差異，接種SPF犬發現致病性也不相同。目前CCoV已確定了兩個基因型，即CCoV-Ⅰ和CCoV-Ⅱ。一般情況下，CCoV會合并感染犬的其他病原體，造成病情加重，然而幾年前報道了一種能夠造成犬全身性疾病、致死率很高的變異CCoV-Ⅱ強毒株，即泛嗜性犬冠狀病毒(CB/05毒株)。

目前檢測犬所使用犬冠狀病毒的引物并不多,且目前發表文獻所使用的引物在使用上有其缺點:1)DNA片段大小小于500bp,2)容易檢測出偽陽性以及3)特異性不佳。有鑒于此,開發用于檢測犬冠狀病毒的通用引物去檢測寵物犬或是流浪犬糞便中冠狀病毒是當務之急,并且可以做為之后福建龍巖地區犬冠狀病毒流行病學調查的依據。

發明內容

本發明的目的在于提供一種用于檢測犬糞便中冠狀病毒的通用引物及試劑盒，可以快速篩檢寵物犬或流浪犬糞便中冠狀病毒的存在并提高篩檢陽性率與準確度。

為了實現上述目的，本發明采用的技術方案是：

用于檢測犬糞便中冠狀病毒的通用引物，所述引物序列如下：

CCoV-MF:5’-GCAACAGGATGGGCTTAC-3’

CCoV-7aR:5’-GCATGGAGGAAAACGAGC-3’

采用上述通用引物檢測犬糞便中冠狀病毒的方法，包括以下步驟：

1)提取病毒RNA，并反轉錄獲得cDNA；

2)以合成的cDNA為模板，以權利要求1中的CCoV-MF和CCoV-7aR為引物，進行PCR擴增反應，預計擴增的目的片段為1290bp，擴增反應總體積為50uL，PCR反應條件如下：95℃預變性5min，95℃變性1min，56℃退火1min，72℃延伸90s，進行30個循環，最后72℃延伸10min，獲得PCR產物；

3)將所得PCR產物置于1％瓊脂糖凝膠進行電泳，在紫外投射儀上觀察并記錄實驗結果。

檢測犬糞便中冠狀病毒的試劑盒，所述試劑盒包括上述通用引物。

本發明的技術思路在于：由于利用PCR技術去檢測寵物犬或是流浪犬糞便中是否含有冠狀病毒存在偽陽性的缺點，因此還需要搭配1)基因組上不同區域DNA片段的引物，2)全基因組測序再次確認有此病原才能真正證實其病原體的存在。

根據美國國家衛生研究院NCBI網站參考犬冠狀病毒M基因以及7a基因序列(登錄號:DQ112226.1)設計通用引物以進行PCR：

CCoV-MF:5’-GCAACAGGATGGGCTTAC-3’

CCoV-7aR:5’-GCATGGAGGAAAACGAGC-3’